肝移植缺血再灌注損傷對(duì)肝、腎、小腸組織細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Fas基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 肝移植作為終末期肝病的唯一有效治療手段正得到廣泛的應(yīng)用，其技術(shù)也日益成熟，病人術(shù)后5年存活率達(dá)到70％以上。隨著高效、強(qiáng)力免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率已明顯降低，影響肝移植術(shù)后早期存活的主要因素越來越集中在肝臟、腎臟、小腸的功能損害方面，肝移植術(shù)后病人并發(fā)移植肝無功能、急性腎功能衰竭、小腸損傷而加重的內(nèi)毒素血癥使病人術(shù)后死亡率明顯增加。 原位肝移植手術(shù)技術(shù)復(fù)雜，經(jīng)歷供肝切取、供肝修整和受體手術(shù)三個(gè)

2、階段。在受體手術(shù)中，門靜脈和下腔靜脈需要阻斷，恢復(fù)血流后肝臟、腎和小腸要經(jīng)歷缺血再灌注損傷。而缺血再灌注損傷是肝移植術(shù)后病人并發(fā)移植肝無功能、急性腎功能衰竭、小腸損傷而加重的內(nèi)毒素血癥的重要因素。細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷早期肝細(xì)胞死亡的主要方式，許多基因參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中目前研究最多，認(rèn)為最主要的調(diào)控基因?yàn)锽cl-2基因及Fas基因。目前研究熱點(diǎn)主要集中在缺血再灌注損傷前后肝臟的細(xì)胞凋亡及干預(yù)方面，對(duì)于肝臟組織在肝移植術(shù)后多長(zhǎng)時(shí)

3、間達(dá)到細(xì)胞凋亡高峰國(guó)內(nèi)外有不同的研究結(jié)果。另外，在原位肝移植手術(shù)中，受體大鼠肝臟切除、供肝植入階段需要阻斷門靜脈及下腔靜脈，此時(shí)腎臟及小腸的動(dòng)脈血供無明顯變化，但是靜脈回流明顯受阻，出現(xiàn)腎臟及小腸器官淤血。當(dāng)門靜脈及下腔靜脈吻合完畢，再次開放時(shí)，腎臟及小腸組織靜脈回流恢復(fù)，淤血得以解除。這一種形式的缺血再灌注損傷稱之為“淤血再灌注損傷”似乎更為準(zhǔn)確，與肝臟所經(jīng)歷的動(dòng)脈缺血后引發(fā)的缺血再灌注損傷相比，其對(duì)機(jī)體的損傷較輕。對(duì)于腎臟及小腸在肝

4、移植“淤血再灌注損傷”前后的細(xì)胞凋亡及基因調(diào)控方面的變化規(guī)律尚未有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過研究原位肝移植缺血再灌注損傷后移植肝、腎臟及小腸組織中的細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律，同時(shí)研究Bcl-2和Fas基因表達(dá)在損傷細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并探討細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Fas基因表達(dá)存在的內(nèi)在相互關(guān)系，進(jìn)一步闡述移植肝無功能、急性腎功能衰竭、小腸損傷而加重的內(nèi)毒素血癥的發(fā)生機(jī)制。無論是在實(shí)驗(yàn)研究還是在臨床上的治療方面具有指導(dǎo)意義。 目的：

5、 (1)探討建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模型的方法，觀察Wistard→Wistard大鼠模型的穩(wěn)定性及是否符合實(shí)驗(yàn)要求，從而建立適宜、可靠的大鼠原位肝移植模型。 (2)對(duì)比研究大鼠肝移植實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的肝、腎臟及小腸組織中的細(xì)胞凋亡變化規(guī)律。 (3)對(duì)比研究大鼠肝移植實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的肝、腎臟及小腸Bcl-2、Fas基因表達(dá)的變化規(guī)律，探討其可能的發(fā)生機(jī)制。 方法： (1)參照Kamada“二袖套法”，加

6、以適當(dāng)改進(jìn)，建立Wistard→Wistard大鼠原位肝移植動(dòng)物模型，并以假手術(shù)組大鼠為對(duì)照組。測(cè)定兩組術(shù)后1、3、6、12、24小時(shí)血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)水平變化。 (2)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠分別于術(shù)后1、3、6、12、24小時(shí)時(shí)分別處死，獲取肝臟、腎臟及小腸組織，對(duì)相應(yīng)的標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查。應(yīng)用免疫組化(SP)法檢測(cè)肝臟、腎臟及小腸組織中凋亡細(xì)胞在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的Fa

7、S蛋白表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞流式技術(shù)及電鏡技術(shù)對(duì)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟、腎臟及小腸組織中凋亡細(xì)胞進(jìn)行定性及定量分析。 (3)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄法(RT-PCR法)檢測(cè)肝臟、腎臟及小腸組織中Bcl-2和Fas基因表達(dá)在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化規(guī)律。 以上數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有顯著性。 結(jié)論： (1)運(yùn)用改良Kamada二袖套法建立穩(wěn)定而確切的Wistard→Wistard大

8、鼠的原位肝移植模型是可行的。 (2)肝移植缺血再灌注可致移植肝、腎和小腸損傷，尤其肝、腎功能損傷明顯，其改變也最顯著： (3)肝移植缺血再灌注損傷可致肝、腎和小腸細(xì)胞凋亡，術(shù)后1小時(shí)即明顯增加，其后逐漸增高，至術(shù)后12小時(shí)至最高。肝臟的細(xì)胞凋亡率最高，小腸的細(xì)胞凋亡率最低。 (4)細(xì)胞凋亡是肝移植缺血再灌注損傷后腎臟及小腸細(xì)胞早期死亡的主要形式。 (5)肝移植缺血再灌注損傷導(dǎo)致肝、腎臟及小腸組織Bcl-2