皮瓣缺血再灌注損傷對皮瓣細胞凋亡及相關凋亡基因FAS表達的影響.pdf

1、目的：觀察皮瓣組織發(fā)生缺血再灌注后形態(tài)學的變化;對比研究皮瓣組織缺血再灌注組與非缺血再灌注組細胞凋亡的變化規(guī)律；對比研究缺血再灌注組與非缺血再灌注組的皮瓣組織不同時間點Fas蛋白的表達情況；對比研究缺血再灌注組與非缺血再灌注組的皮瓣組織在不同時間點相關凋亡基因Fas的表達情況。以闡明Fas基因在皮瓣缺血再灌注中的作用，探討缺血再灌注損傷時細胞凋亡與Fas基因的關系，為從基因水平，防治皮瓣缺血再灌注損傷，提高皮瓣成活率，提供新思路和理論依

2、據(jù)。
　　 方法：
　　 1.實驗動物：雄性健康清潔級WISTAR大鼠50只，稱重、編號。
　　 2.動物模型建立：于皮瓣制作前三天，各組大鼠用8％的硫化鈉腹部脫毛備皮（面積為4×10cm2），溫水沖洗后自然晾干。以3％戊巴比妥鈉（40mg/Kg體重）腹腔注射麻醉，每3小時追加麻醉一次（20mg/Kg體重）以維持麻醉。麻醉成功后大鼠仰臥位，四肢固定，75％酒精消毒，于右下腹設計一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小約

3、3 cm×6 cm。
　　 3.實驗動物分組：將大鼠分為兩組，(1)非-IR組25只：皮瓣形成后原位縫合，不做任何處理。時間點的選取以形成皮瓣后8h、9h、14h、20h、32h分為五組與實驗組形成對照，每組五只大鼠。IR組25只：皮瓣形成后，微血管夾夾閉腹壁淺動脈發(fā)出點近端的股動脈，手術顯微鏡下觀察，確認血流阻斷后，3-0絲線原位縫合皮瓣，切口再次消毒。8h后再次手術去除血管夾，并經(jīng)手術顯微鏡下觀察，確認恢復血流，再灌注成功。

4、按去除動脈夾血管再灌注后0h、1h、6h、12h、24h分為五組，每組五只大鼠。
　　 4.取材：非-IR組和IR組按照各組時間點的要求，分別于皮瓣中間邊緣處取皮瓣組織1.0cm×0.5cm，所取標本中一部分用多聚甲醛迅速固定待做石蠟切片及免疫組化染色，準備做細胞凋亡和Fas的檢測。部分液氮冰凍后，置冰箱中保存，以備RT-PCR檢測。
　　 5.檢測方法及觀測指標
　　 5.1 組織學檢查：將石蠟切片進行HE染色

5、，觀察組織結構改變。
　　 5.2 凋亡細胞原位末端標記（TUNEL法）檢測：應用TUNEL法原位標記DNA片段檢測皮瓣組織不同時間點凋亡細胞，凋亡細胞陽性指數(shù)用平均陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值表示(AI，AI=凋亡細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100％)。
　　 5.3 Fas基因蛋白表達檢測：應用免疫組化(SP)法檢測皮瓣組織中凋亡細胞在術后不同時間點Fas蛋白表達。用計算機圖象分析系統(tǒng)分析單位面積下陽性細胞的平均灰度值，分別

6、取其平均值表示該切片F(xiàn)as蛋白表達的情況。
　　 5.4 Fas mRNA表達檢測：應用RT-PCR檢測皮瓣組織中Fas基因表達在術后不同時間點的表達變化規(guī)律。用凝膠圖象分析系統(tǒng)（武漢同濟醫(yī)科大學HMIAS-2000型）對目的電泳條帶進行分析，以相應的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度的比值表示。
　　 6.統(tǒng)計學處理：所有的試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（（X）±S）表示，采用SPSS16軟件進行檢驗，顯著性分析以P

7、＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.HE染色觀測結果： IR組較非-IR組比較，皮下水腫較明顯，皮膚各層結構紊亂、疏松、有大量的炎性細胞聚集、粘附于微血管內(nèi)皮細胞，微血管管壁損傷，完整性破壞，有大量炎性細胞滲出到組織間隙，部分紅細胞堆積在毛細血管和微靜脈周圍。
　　 2.TUNEL法觀察細胞凋亡：應用TUNEL法對皮瓣組織的凋亡細胞檢測，發(fā)現(xiàn)IR組及非-IR組均發(fā)生細胞凋亡，陽性細胞主要位于

8、表皮層，皮下組織偶可見散在陽性細胞。IR組明顯高于非-IR組(P＜0.05)。
　　 3.Fas蛋白的表達：本實驗觀測到，在非-IR組中皮瓣組織Fas蛋白表達為弱陽性平均灰度值在每個時間點間差別無統(tǒng)計學意義。 IR隨著缺血和再灌注時間的增加，F(xiàn)as蛋白表達急速上升，到再灌注后12h達到了高峰，陽性細胞可連成線片狀，染色最深，24h表達減弱。非-IR組與IR組通過SPSS分析有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4.Fas

9、 mRNA的表達：應用RT-PCR法發(fā)現(xiàn)在非-IR組中皮瓣組織Fas基因表達弱陽性，各個時間點的變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 IR組隨著缺血再灌注時間延長，F(xiàn)as基因表達水平程增高趨勢，到再灌注后12h達到高峰，IR24h組較IR12h組表達減弱。非-IR組與IR組通過SPSS分析有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結論
　　 1.皮瓣缺血再灌注損傷后可加速細胞凋亡。
　　 2.皮瓣組織缺血再灌注損傷時，