NESTORON較孕酮具有更強的潛力調(diào)節(jié)人精子獲能和頂體反應(yīng).pdf

1、目的:
　　 探討NES對人精子運動狀態(tài)、獲能、頂體反應(yīng)有調(diào)節(jié)作用及其調(diào)節(jié)人精子獲能和頂體反應(yīng)可能的作用機制。
　　 方法:
　　 1.精子標本采集和處理培養(yǎng):精子標本一部分來自于自愿捐獻者,一部分來自于浙江省精子庫。取精者禁欲3-7天,精子的質(zhì)量符合WHO(1999)標準,精漿與預(yù)溫HTF培養(yǎng)基等量混勻后,300×g離心6min,棄去上清,精子用2ml的HTF進行懸浮；精子懸液后再用45％-90％Percoll

2、間斷密度梯度離心(600×g,18 min)；所得下層活力較好精子再用約10倍HTF懸浮,300×g離心5 min；棄去上清液,再用HTF調(diào)整精子密度到2-3 X107 cells/ml。處理好的精子進行分組,分別加入NESTORONE(10-9-10-6 M)、GABA、孕酮(PROGESTERONE；10-9-10-6M)、GABAA受體拈抗劑(BICUCULLINE)、L-型鈣離子通道抑制劑(VERAPAMIL AND NIFED

3、IPINE),獲能條件培養(yǎng)1-5hr。
　　 2.CASA評價精子活動率和運動活力:計算機輔助的精液分析(CASA)分析精子活力。精子活力是指活動精子的運動能力,是測定精子活動能力的定性方法；精子活動率是指精子總數(shù)中活精子所占比例,是測定活精子和死精子的定量方法。精子活動力與活動率取決于有鞭毛運動精子的百分率。
　　 3.精子獲能和頂體反應(yīng)的評價:精子培養(yǎng)后,4％多聚甲醛固定人精子作CTC染色。用一種可與DNA結(jié)合的熒光

4、染料Hochest33258(H258)對精子進行預(yù)染色,避免死精子或細胞碎片影響實驗結(jié)果。以精子與金霉翥(CTC)熒光結(jié)合類型為指標來評價精子獲能情況。
　　 4.精子穿通去透明帶倉鼠卵子:哺乳動物卵子的透明帶在異種動物的精卵細胞受精過程中起著重要的障礙作用。Yanagimachi等人發(fā)現(xiàn)用酶可除去倉鼠卵的透明帶,人精子能夠使去透明帶倉鼠卵受精,形成雄性原核,用倉鼠卵替代人卵可用來估計人精子的受精能力。
　　 5.免疫

5、熒光:處理好的人精子標本加入分別含有NES和P4的培養(yǎng)基培養(yǎng)3hr,培養(yǎng)后4％多聚甲醛固定過夜,調(diào)精子密度1-2×107 cells/ml,精子標本涂于經(jīng)過多聚賴氨酸處理過的玻片；濕盒晾干玻片；PBS洗玻片3次,每次5分鐘；BSA封閉精子標本1hr；PBS洗玻片3次,每次5分鐘；一抗過夜；PBS洗玻片3次,每次5分鐘；加二抗暗盒1hr；蓋蓋玻片暗盒保存以備觀察結(jié)果。
　　 6.精子胞內(nèi)鈣離子測定:人精子在37℃培養(yǎng)5小時使其充分

6、獲能,培養(yǎng)后的精子加Fura-2/AM避光37℃培養(yǎng)30分鐘,沖洗300×g3次每次5分鐘,洗去細胞外自由Fura-2/AM。精子密度調(diào)至10-20×106個/ml。負載Fura-2/AM精子,采用340納米和380納米(發(fā)射光波長510納米)的激發(fā)波長,每20秒取一次結(jié)果(Shimadzu RF-540 Spectroflurometer,Shimadzu Co,Kyoto,Japan)。熒光強度(F340/F380)來評價[Ca2+

7、]i。
　　 結(jié)果:
　　 NES顯著促進人精子的超激活運動和精子尾部酪氨酸蛋白磷酸化；NES調(diào)節(jié)人精子獲能(MEC=10-9M；EC50=9.5±1.0nM)作用強于孕酮P4(MEC=10-7M,EC50=237.1±2.4 nM.)；NES促進人靜穿透去透明帶卵子；NES所致人精子獲能作用能被荷包牡丹堿和木防已苦毒素阻斷；氯離子和鈣離子是NES調(diào)節(jié)精子獲能所必須的；精子培養(yǎng)5h獲能后,獲能后精子NES和P4誘發(fā)精子A