脂肪來(lái)源的干細(xì)胞（ADSCs）的可塑性及在修復(fù)牙槽骨缺損中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，種子細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題已經(jīng)成為制約其發(fā)展的一個(gè)重要的因素。自ADSCs發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們對(duì)其的研究不斷深入。近幾年，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ADSCs可以向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等不同胚層來(lái)源的細(xì)胞分化。而且脂肪組織來(lái)源廣泛、取材容易、便于自體移植；ADSCs在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的過(guò)程中始終保持其多向分化潛能、遺傳背景相當(dāng)穩(wěn)定、體內(nèi)植入后少有免疫排斥的問(wèn)題，因而是一種非常理想的組織工程種子細(xì)胞。本課題

2、對(duì)其生物學(xué)特性、可塑性以及復(fù)合PLGA后對(duì)修復(fù)牙槽骨的缺損進(jìn)行了研究，以期為ADSCs進(jìn)一步的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分目的：研究ADSCs的生物學(xué)特性及遺傳學(xué)特性。方法：從人脂肪組織中分離出干細(xì)胞；利用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)；利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cellcountingkit-8)測(cè)定其生長(zhǎng)特性；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志及細(xì)胞周期；利用染色體核型分析技術(shù)檢測(cè)第20代細(xì)胞的遺傳學(xué)特性。結(jié)果：ADSCs在體外呈長(zhǎng)梭形；群體倍增

3、時(shí)間約為29h；在其表面分子中CD29、CD90、CD44呈陽(yáng)性；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞80％以上處于G0和G1期；第20代細(xì)胞仍具有正常的二倍體核型。結(jié)論：ADSCs分離培養(yǎng)容易、增殖速度穩(wěn)定、增殖能力較強(qiáng)、遺傳學(xué)穩(wěn)定性良好。 第二部分目的：檢測(cè)ADSCs的可塑性。方法：①利用地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉等將其向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并對(duì)誘導(dǎo)21d后的細(xì)胞進(jìn)行AKP和VonKossa染色；②用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(isobu

4、ty1-methylxanthine，IBMX)、地塞米松、胰島素、吲哚美辛等將其向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并對(duì)誘導(dǎo)21d后的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色；③利用3bFGF、ATRA(全反維甲酸)、BME、BHA及DMSO等將其向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并對(duì)誘導(dǎo)14d后的細(xì)胞進(jìn)行NSE和GFAP免疫組織化學(xué)染色；④利用HGF和FGF-4等將其向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化，對(duì)誘導(dǎo)7d和14d后的細(xì)胞進(jìn)行AFP、CK-18和ALB的免疫熒光染色，利用RT-PCR的方法檢測(cè)誘

5、導(dǎo)7d和14d后的細(xì)胞目的基因的表達(dá)量；⑤利用bFGF和EGF等將其向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并對(duì)誘導(dǎo)14d后的細(xì)胞進(jìn)行VWF、FLT-1、FLK-1和CD34免疫熒光染色。結(jié)果：向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后，AKP和VonKossa染色均為陽(yáng)性；向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后，油紅O染色陽(yáng)性；向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，NSE和GFAP免疫組織化學(xué)染色均為陽(yáng)性；向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，分化后的細(xì)胞AFP、CK-18和ALB的免疫熒光染色均為陽(yáng)性，RT-PCR結(jié)果顯示：分化后的

6、細(xì)胞均表達(dá)AFP、CK-18和ALB；向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，VWF、FLT-1、FLK-1和CD34免疫熒光染色均為陽(yáng)性。結(jié)論：ADSCs可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞等三個(gè)不同胚層來(lái)源的細(xì)胞分化，具有良好的可塑性。 第三部分目的：以兔ADSCs為種子細(xì)胞，PLGA為支架材料，通過(guò)組織工程的原理和方法修復(fù)牙槽骨缺損。方法：取兔腹股溝處脂肪墊，用差異貼壁的方法分離培養(yǎng)ADSCs；條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)后進(jìn)行免疫組

7、織化學(xué)染色；將細(xì)胞和支架材料復(fù)合，掃描電鏡觀察細(xì)胞和支架材料的生物相容性；制備動(dòng)物模型，將實(shí)驗(yàn)分為四組：預(yù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組移植附著細(xì)胞的且經(jīng)過(guò)體外預(yù)誘導(dǎo)3d的PLGA；非預(yù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組移植附著細(xì)胞的且不經(jīng)過(guò)體外預(yù)誘導(dǎo)的PLGA；材料對(duì)照組移植單純的支架材料；空白對(duì)照組不做任何處理。12周后處死動(dòng)物，組織學(xué)方法檢測(cè)新骨形成情況，比較各組之間的差異。結(jié)果：體外經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的ADSCs表現(xiàn)出了成骨細(xì)胞的活性；掃描電鏡結(jié)果顯示：細(xì)胞在支架材料表面生長(zhǎng)良好，

8、呈長(zhǎng)梭形。12周后，預(yù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨再生高度為3.7mm±0.6mm，修復(fù)率為74％；非預(yù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨再生高度為2.8mm±0.6mm，修復(fù)率為56％；材料對(duì)照組骨4再生高度為1.1mm±0.4mm，修復(fù)率為22％；空白對(duì)照組骨再生高度為0.9mm±0.5mm，修復(fù)率為14％。兩實(shí)驗(yàn)組之間以及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的牙槽骨再生高度以及修復(fù)率均有顯著性差異。結(jié)論：利用PLGA復(fù)合自體ADSCs有良好的新骨形成能力，在牙槽骨和頜骨缺損中有著良好的