PAX4、NeuroD1基因多態(tài)性與自身抗體陰性酮癥傾向糖尿病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、酮癥傾向糖尿病(ketosis-prone diabetes,KPD)是一種以無誘因的酮癥或酮癥酸中毒起病而臨床表現(xiàn)異質(zhì)性很大的綜合癥，它包括自身免疫性1型糖尿?。?A型）和胰島自身抗體陰性的特發(fā)1型糖尿病（1B型）。目前對(duì)于胰島自身抗體陰性的KPD的病因知之甚少，由于該類患者體內(nèi)缺乏自身免疫破壞β細(xì)胞的證據(jù)，因此，遺傳和環(huán)境因素可能是其主要病因，在遺傳性因素中影響β細(xì)胞分化成熟和胰島素分泌的轉(zhuǎn)錄因子如PAX4、NeuroD1、PDX1

2、等近年來受到研究者的關(guān)注。但在已有的相關(guān)研究中缺乏中國人群的研究，有關(guān)多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析手段也相對(duì)簡單。因此本研究選擇與β細(xì)胞分化成熟和胰島素分泌有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PAX4和NeuroD1基因作為候選基因，設(shè)計(jì)一個(gè)兩步的病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析，即首先在小樣本人群中應(yīng)用變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)進(jìn)行PAX4基因突變篩查，從檢測出的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)中選擇等位基因頻率＞1％的

3、4個(gè)SNP，加上我們在另一研究中已對(duì)NeuroD1基因篩查出的一個(gè)SNP，在所有樣本中對(duì)兩基因的5個(gè)SNP進(jìn)行基因分型及關(guān)聯(lián)分析。通過采用單點(diǎn)分析，單倍型分析與多點(diǎn)聯(lián)合作用分析相結(jié)合的關(guān)聯(lián)分析方法，探討這些基因的多態(tài)性對(duì)中國漢族自身抗體陰性KPD易感性的影響。
　　 第一部分、胰島自身抗體陰性酮癥傾向糖尿病的PAX4基因突變篩查
　　 目的：建立變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)的檢測方法，篩查中國漢族胰島自身抗體陰性的

4、酮癥傾向糖尿病(KPD)的PAX4基因突變
　　 設(shè)計(jì)：病例-對(duì)照研究
　　 方法：采用變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)結(jié)合直接測序法，檢測141例胰島自身抗體GAD-Ab和IA-2A陰性的酮癥起病糖尿病患者和112例非糖尿病正常對(duì)照者的PAX4基因的九個(gè)外顯子區(qū)的突變情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功建立了DHPLC檢測PAX4基因的方法。
　　 2.DHPLC檢測到PAX4基因的外顯子1、

5、4、5、9分別有2、137、41和86例出現(xiàn)異常峰型，經(jīng)測序證實(shí)均有堿基改變，檢出符合率100％。
　　 3.共檢測到PAX4基因9個(gè)外顯子區(qū)的7種堿基改變，它們分別是：外顯子1的錯(cuò)義突變Arg31Gln(G298A)，外顯子4的同義突變Gln173Gln(A725G,rs327517)和錯(cuò)義突變Lys147Arg(A649G)，外顯子5的錯(cuò)義突變Arg183Cys(C753T)、Arg192Ser(C780A,rs382400

6、4)和Arg192His(G781A,rs2233580)，外顯子9的錯(cuò)義突變His321Pro(A1168C,rs712701)。其中外顯子4的錯(cuò)義突變Lys147Arg(A649G)為新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 在中國漢族人群中，PAX4基因有6種常見多態(tài)性改變，分別為Arg31Gln、Gln173Gln、Arg183Cys、Arg192Ser、Arg192His、His321Pro。
　　 第二

7、部分、自身抗體陰性KPD的PAX4基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究
　　 目的：探討PAX4基因多態(tài)性與中國漢族胰島自身抗體陰性酮癥傾向糖尿病(KPD)的關(guān)系。
　　 設(shè)計(jì)：病例-對(duì)照研究
　　 方法：采用多聚酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測296例胰島自身抗體GAD-Ab和IA-2A陰性的KPD患者、399例正常對(duì)照者的PAX4基因外顯子9的多態(tài)性His321Pro的基因型。采用PCR-直接測序法檢測

8、PAX4基因外顯子5的多態(tài)性Arg183Cys、Arg192Ser、Arg192His的基因型。分析PAX4基因各多態(tài)性與KPD的關(guān)系，同時(shí)分析各多態(tài)性位點(diǎn)所構(gòu)成的單體型與KPD的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.自身抗體陰性的KPD患者PAX4Arg183Cys的CT基因型和T等位基因頻率與正常對(duì)照者比較，差異均無顯著性。CT基因型患者與CC基因型患者的BMI(P＝0.025)和FCP水平(P＝0.024)比較差異均有顯

9、著性。
　　 2.自身抗體陰性的KPD患者與正常對(duì)照組比較，Arg192Ser的AA基因型(0.7％vs0％,x2＝8.183,P＝0.015)和A等位基因頻率(6.6％VS3.4％,OR＝2.014,95％CI＝1.218～3.329,P＝0.005)明顯增高。其中，男性(6.7％vs3.5％,P＝0.03)和起病年齡＜20歲(9.6％vs3.4％,P＝0.003)的KPD患者A等位基因頻率高于正常對(duì)照。
　　 3.自

10、身抗體陰性的KPD患者PAX4基因Arg192His的AA基因型(16.9％vs10.0％,P＝0.04)和A等位基因頻率(10.6％VS6.8％,OR＝1.641,95％CI＝1.122～2.400,P＝0.01)高于正常對(duì)照者。女性(10.8％vs5.6％,P＝0.04)和起病年齡≥20歲(11.1％vs6.8％,P＝0.007)的KPD患者的A等位基因頻率高于正常對(duì)照。
　　 4.自身抗體陰性的KPD患者PAX4基因His

11、321Pro各基因型頻率和等位基因頻率與對(duì)照組比較，差異均無顯著性(P＞0.05)。男性KPD患者的CC基因型(15％vs12.1％,x2＝6.74,P＝0.03)和C等位基因頻率(40.3％vs31.9％,x2＝4.25,P＝0.04)均高于女性KPD患者。
　　 5、自身抗體陰性的KPD患者PAX4基因單體型AACC的頻率(8.8％vs5.2％,X2＝7.199,OR＝1.778,95％CI＝1.164～2.717,P＝0.

12、007)和單體型CGAC的頻率(4.0％vs2.0％,x2＝4.611,OR＝2.065,95％CI＝1.087～3.923,P＝0.032)均高于正常對(duì)照。而單體型CGCC在正常對(duì)照組中的頻率高于起病年齡≥35歲KPD患者(35.7％vs28.7％,x2＝4.64,OR＝0.725,95％CI＝0.54～0.975,P＝0.031)。
　　 結(jié)論：
　　 1.PAX4基因Arg192Ser和Arg192His多態(tài)性與中

13、國漢族胰島自身抗體陰性的KPD有關(guān)聯(lián)。
　　 2.PAX4基因單體型AACC和單體型CGAC是中國漢族胰島自身抗體陰性的KPD的易感單體型，單體型CGCC是起病年齡≥35歲KPD患者的保護(hù)性單體型。
　　 第三部分、NeuroD1基因A45T多態(tài)性與自身抗體陰性KPD的關(guān)系
　　 目的：探討NeuroD1基因A45T多態(tài)性與中國漢族胰島自身抗體陰性酮癥傾向糖尿病(KPD)的關(guān)系。設(shè)計(jì)：病例-對(duì)照研究。
　　

14、 方法：采用PCR-測序法檢測NeuroD1基因A45T基因型，分析NeuroD1基因A45T多態(tài)性與KPD的關(guān)系，同時(shí)分析NeuroD1基因A45T多態(tài)性與PAX4基因各多態(tài)性位點(diǎn)的交互作用對(duì)KPD的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.自身抗體陰性的KPD患者NeuroD1基因A45T的AA基因型頻率和A等位基因頻率與NC組比較差異均無顯著性(P＝0.34)。對(duì)患者進(jìn)行年齡和性別分層后仍沒有發(fā)現(xiàn)NeuroD1基因A45T

15、基因型頻率與對(duì)照組有差別。
　　 2.選擇PAX4基因的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)C780A、G781A、C1168A與NeuroD1基因的Ala45Thr多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)KPD的交互作用分析。結(jié)果顯示，Ala45Thr多態(tài)性與PAX4的各多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)KPD沒有交互作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.NeuroD1基因的Ala45Thr多態(tài)性與中國漢族自身抗體陰性的KPD沒有相關(guān)性。
　　 2.NeuroD1基因的Ala4