節(jié)旋藻色基裂合酶基因cpcS,cpcT,cpcU的克隆及在有光學(xué)活性藻藍(lán)蛋白β亞基生物合成中的功能研究.pdf

1、鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospira platensis)是一種具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)微藻,其富含藻藍(lán)蛋白,藻藍(lán)蛋白具有抗氧化,抗腫瘤等作用,還可作為一種天然色素,廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝等行業(yè),此外由于其所特有的熒光活性且無(wú)毒,還可用作熒光標(biāo)記物及光動(dòng)力治療等領(lǐng)域。近年來(lái),通過基因工程手段表達(dá)具有光學(xué)活性藻藍(lán)蛋白研究取得了較多的成果,為有光學(xué)活性藻藍(lán)蛋白的應(yīng)用及構(gòu)建新的光合系統(tǒng)提供了基礎(chǔ)。
　　光學(xué)活性藻藍(lán)蛋白的合成過程中重要的一

2、步是藻藍(lán)膽素與脫輔基蛋白的共價(jià)偶聯(lián),而藻藍(lán)膽素與脫輔基蛋白的正確連接需要特定的色基裂合酶的催化。光學(xué)活性藻膽蛋白的生物合成一般需要脫輔基藻藍(lán)蛋白(CpcA,CpcB),色基合成酶(Hox1,PcyA),色基裂合酶三種元件的共同參與。本實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白α亞基的色基裂合酶的研究已經(jīng)比較完整,但是還沒有關(guān)于節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白β亞基色基裂合酶的研究,因此本論文克隆了節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白β亞基的色基裂合酶,并研究了其功能。
　　本論文首次

3、克隆了鈍頂節(jié)旋藻A. platensis FACHB314的色基裂合酶基因cpcS,cpcT和cpcU,其中cpcS全長(zhǎng)594bp,編碼197個(gè)氨基酸序列,分子量為22.1kDa,blastp比對(duì)其屬于CpeS superfamily,存在5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,分別是THHL,ENH,LRERGYAEI,YETM和ERF,氨基酸序列的同源比對(duì)結(jié)果顯示與其他藍(lán)藻的序列相似度為72.52％;cpcT基因全長(zhǎng)597bp,編碼198個(gè)氨基酸殘基,等電

4、點(diǎn)為5.29,分子量為22.8kDa,blastp比對(duì)其屬于CpeT superfamily,具有FSN,NPP,AHI,RPL,EQAY,PYR和FKG七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,氨基酸序列的同源比對(duì)結(jié)果顯示與其他藍(lán)藻的序列相似度為71.14%;cpcU基因全長(zhǎng)525bp,編碼174個(gè)氨基酸殘基,等電點(diǎn)為5.30,分子量為19.2kDa,blastp比對(duì)其屬于CpeS superfamily,具有7個(gè)保守域,分別是EFF,SAGKWFS,GKS,

5、 EER,PNLR,ASF和SEIR,氨基酸序列的同源比對(duì)結(jié)果顯示與其他藍(lán)藻的序列相似度為73.22%。
　　為了研究節(jié)旋藻的色基裂合酶CpcS,CpcT和CpcU在藻藍(lán)蛋白β亞基與藻藍(lán)膽素結(jié)合過程的作用,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了3個(gè)重組表達(dá)載體:pACYCDuet-cpcB-cpcS(含有藻藍(lán)蛋白β亞基基因cpcB和色基裂合酶 cpcS基因), pACYCDuet-cpcB-cpcT(含有藻藍(lán)蛋白β亞基基因cpcB和色基裂合酶cpcT基因)

6、和pACYCDuet-cpcB-cpcU(含有藻藍(lán)蛋白β亞基基因cpcB和色基裂合酶cpcU基因),并將這3個(gè)載體和pACYCDuet-cpcB(僅含有藻藍(lán)蛋白β亞基基因cpcB)分別與pET24-hox1-pcyA(含有色基合成酶hox1和pcyA基因)一起轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中,構(gòu)建重組表達(dá)菌株BS,BT,BU和B,并誘導(dǎo)蛋白表達(dá),SDS-PAGE和Western Blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況,熒光光譜檢測(cè)重組蛋白的熒光強(qiáng)度,

7、結(jié)果顯示重組菌株中均表達(dá)出了藻藍(lán)蛋白,而且有色基裂合酶存在的菌株比沒有色基裂合酶的菌株表達(dá)的藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度高,而且熒光發(fā)射峰更接近天然藻藍(lán)蛋白,說(shuō)明色基裂合酶對(duì)光學(xué)活性藻藍(lán)蛋白β亞基的合成具有一定的催化作用。
　　為了進(jìn)一步研究這三個(gè)色基裂合酶在藻藍(lán)蛋白β亞基上的作用位點(diǎn),通過將節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白β亞基82位和153位的半胱氨酸分別進(jìn)行突變,突變成丙氨酸,構(gòu)建突變菌株B(C82A)S,B(C153A)S,B(C82A)T,B(C1

8、53A)T,B(C82A)U和B(C153A)U。通過比較突變菌株與未突變菌株表達(dá)的藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度來(lái)分析色基裂合酶的作用位點(diǎn)。結(jié)果顯示,突變菌株B(C82A)T與未突變菌株BT的單位質(zhì)量藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度基本保持一致,而突變菌株B(C153A)T的單位質(zhì)量藻藍(lán)蛋白熒光強(qiáng)度比未突變菌株要低,因此推斷色基裂合酶CpcT的作用位點(diǎn)是β亞基153位的半胱氨酸;而突變菌株B(C153A)S與未突變菌株BS相比,單位質(zhì)量藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度基本沒

9、有變化,而突變菌株B(C82A)S的熒光強(qiáng)度發(fā)生下降,因此推斷裂合酶CpcS的作用位點(diǎn)為β亞基82位的半胱氨酸;突變菌株B(C153A)U與未突變菌株BU相比,單位質(zhì)量藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度基本沒有變化,而突變菌株B(C82A)U的熒光強(qiáng)度發(fā)生下降,因此推斷裂合酶CpcU的作用位點(diǎn)也為β亞基82位的半胱氨酸。
　　本研究首次克隆并研究了節(jié)旋藻中藻藍(lán)蛋白β亞基色基裂合酶CpcS,CpcT和CpcU的功能,為闡明節(jié)旋藻中有光學(xué)活性藻藍(lán)蛋白