iNOS mRNA在慢性鼻竇炎鼻內(nèi)鏡術(shù)后組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、慢性鼻竇炎是一種很常見的鼻部疾病.其病因目前認(rèn)為是鼻部微環(huán)境的炎癥反應(yīng),其發(fā)病多認(rèn)為是多因素多步驟共同作用的結(jié)果.慢性鼻竇炎治愈標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)是粘膜炎癥的徹底消除.雖然目前功能性鼻內(nèi)鏡鼻竇手術(shù)對(duì)治療慢性鼻竇炎的有效性已被臨床實(shí)踐所證明,但是鼻內(nèi)鏡手術(shù)后鼻粘膜上皮的創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過程.如何減輕術(shù)后鼻粘膜炎癥的持續(xù)狀態(tài),加快粘膜上皮的創(chuàng)傷修復(fù)是現(xiàn)今鼻內(nèi)鏡外科急需解決的棘手問題.NO屬于神經(jīng)遞質(zhì)等富反應(yīng)性的極小氣體分子,在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著

2、重要作用.NO是在一氧化氮合酶(NOS)作用下合成的.NOS分3型:神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘發(fā)型NOs(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS).nNOS和eNOS統(tǒng)稱為結(jié)構(gòu)型,主要調(diào)節(jié)生理功能.INOS主要在病理情況下產(chǎn)生,在疾病的發(fā)病和病理過程中起重要作用.iNOS在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá),受炎癥因子刺激后活化產(chǎn)生大量一氧化氮,NO通過其細(xì)胞毒性作用損傷細(xì)胞,增加微血管通透性,抑制血小板聚集及粘附等作用,從而促進(jìn)組織水腫形成. 本文應(yīng)用原

3、位雜交技術(shù),測(cè)定iNOS mRNA在慢性鼻竇炎鼻內(nèi)鏡術(shù)后組織中的分布和表達(dá)水平,探討NO和iNOS在慢性鼻竇炎手術(shù)后鼻粘膜上皮的創(chuàng)傷修復(fù)過程中的作用和臨床意義. 一.材料和方法 1.實(shí)驗(yàn)材料收集2006年在浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受鼻內(nèi)鏡手術(shù)并進(jìn)行復(fù)診的慢性鼻竇炎(Ⅱ型)患者,共30例,其中Ⅱ型1期3例Ⅱ型,2期15例, Ⅱ型3期12例.根據(jù)復(fù)診時(shí)間,分為三組,分別為術(shù)后一月組、術(shù)后三月組、術(shù)后六月組.各例患者在鼻內(nèi)鏡復(fù)診

4、時(shí)取鉤突切除后的切緣中部的組織,直徑約0.5cm.及時(shí)石蠟包埋,分批進(jìn)行原位雜交.另選8例Ⅱ型慢性鼻竇炎患者的息肉組織和5例健康人的鼻粘膜作為對(duì)照組. 2.實(shí)驗(yàn)方法(1)取手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本,用4﹪多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)(含1/1000的DEPC)固定一小時(shí). (2)常規(guī)脫水、浸蠟、包埋.切片,厚度8μm. (3)石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水.30﹪H

5、<,2>O<,2> 1份+蒸餾水10份混合,室溫10分鐘以滅活內(nèi)源性酶.蒸餾水洗3次,每次5分鐘. (4)暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3﹪檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3﹪檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶,混勻),37℃恒溫水浴箱內(nèi)消化30分鐘.原位雜交用PBS洗3次×5分鐘.蒸餾水洗1次×5分鐘. (5)后固定:固定液為1﹪多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含

6、有1/1000 DEPC.室溫固定10分鐘.蒸餾水洗滌3次×5分鐘 (6)預(yù)雜交:按每張切片20μι加預(yù)雜交液.恒溫水浴箱42℃4小時(shí).吸取多余液體,不洗. (7)雜交:按每張切片20 μι雜交液,加在切片上.將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后,蓋在切片上.恒溫箱42℃雜交過夜. (8)雜交后洗滌:揭掉蓋玻片,原位雜交用PBS洗3次×15分鐘.

7、 (9)滴加封閉液:37℃恒溫水浴箱30分鐘.甩去多余液體,不洗. (10)滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃恒溫水浴箱90分鐘.原位雜交用PBS洗5分鐘×4次.C (11)滴加SABC:37℃恒溫水浴箱30分鐘.原位雜交用PBS洗5分鐘×3次. (12)滴加生物素化過氧化物酶:37℃恒溫水浴箱20分鐘.原位雜交用PBS洗5分鐘×4次.

8、 (13)DAB顯色:顯色15分鐘,充分水洗5分鐘. (14)蘇木素復(fù)染30秒,充分水洗15分鐘. (15)干燥后,中性樹膠封片,鏡檢. 二.結(jié)果 顯微鏡下見原位雜交陽性的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色,而陰性細(xì)胞的胞漿則呈普通的淡藍(lán)色.正常鼻黏膜組可見iNOS mRNA陽性細(xì)胞主要分布在黏膜下,數(shù)量極少.Ⅱ型慢性鼻竇炎息肉組可見陽性細(xì)胞在黏膜下腺體周圍及血管周圍均有大量分布.

9、Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后一月組及三月組中可見陽性細(xì)胞在黏膜下腺體及血管周圍有分布,Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后六月組可見iNOS mRNA陽性細(xì)胞主要分布在黏膜下,數(shù)量極少. 在400倍光鏡下,觀察并計(jì)數(shù)切片中陽性表達(dá)的細(xì)胞.iNOS mRNA陽性細(xì)胞在正常鼻黏膜和慢性鼻竇炎鼻息肉組織及慢性鼻竇炎鼻內(nèi)鏡手術(shù)后組織中都有陽性表達(dá).在正常鼻黏膜組織中,iNOS mRNA的陽性細(xì)胞率為(1.18±0.24)﹪;在Ⅱ型慢性鼻竇炎的組織中,iNOs mR

10、NA的陽性細(xì)胞率為(18.43±4.31)﹪;在Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后一月組織中,iNOS mRNA的陽性細(xì)胞率為(15.40±1.64)﹪; 在Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后三月組織中,iNoS mRNA的陽性細(xì)胞率為(8.34±0.78)﹪;在Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后六月組織中,iNOS mRNA的陽性細(xì)胞率為(1.31±0.27)﹪.Ⅱ型慢性鼻竇炎息肉組iNOS mRNA陽性細(xì)胞率較正常的鼻黏膜組明顯升高,t檢驗(yàn),p<0.05,差異有顯著性意義.Ⅱ型慢

11、性鼻竇炎術(shù)后一月組iNOS mRNA陽性細(xì)胞率較II型慢性鼻竇炎組無明顯降低,p>0.05,差異無顯著性意義.Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后三月組iNOS mRNA陽性細(xì)胞率較II型慢性鼻竇炎組明顯降低,t檢驗(yàn),p<0.05,差異有顯著性意義:較Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后一月組明顯降低,t檢驗(yàn),p<0.05,差異有顯著性意義;較正常的鼻黏膜組明顯升高,t檢驗(yàn),p<0.05,差異有顯著性意義.Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后六月組iNOS mRNA陽性細(xì)胞率較Ⅱ型慢性鼻竇

12、炎術(shù)后一月組明顯降低,t檢驗(yàn),p<0.05,差異有顯著性意義;較Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后三月組明顯降低,t檢驗(yàn),p<0.05,差異有顯著性意義;較正常鼻黏膜組無明顯升高,t檢驗(yàn),p>0.05,差異無顯著性意義. 三.結(jié)論 1)在正常鼻粘膜中可有iNOS mRNA陽性低表達(dá),說明iNOS這種低表達(dá)是維持正常鼻腔生理功能所必需的. 2)本檢測(cè)中Ⅱ型慢性鼻竇炎息肉組織以及術(shù)后一月組織、三月組織中中iNOS mRNA陽性細(xì)胞率

13、較正常的鼻黏膜組織明顯升高,并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這說明了iNOS和NO在慢性鼻竇炎以及術(shù)后粘膜炎癥持續(xù)狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制中起到一定的作用. 3)本檢測(cè)中Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后一月組織、三月組織、六月組織之間iNOSmRNA陽性細(xì)胞率有顯著差異,并隨術(shù)后時(shí)間推延表達(dá)逐漸減少.說明NOS表達(dá)的增加和隨后引起的NO釋放可能在慢性鼻竇炎以及術(shù)后粘膜炎癥持續(xù)狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制中起到一定的作用.Ⅱ型慢性鼻竇炎術(shù)后一月組織中iNOS mRNA陽性細(xì)胞率較Ⅱ