海洋嗜殺酵母的篩選、嗜殺因子的純化及其基因的克隆.pdf

1、中國(guó)海洋大學(xué)博士學(xué)位論文海洋嗜殺酵母的篩選、嗜殺因子的純化及其基因的克隆姓名：王祥紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：海洋生物指導(dǎo)教師：池振明20070528海洋嗜殺酵母的篩選、嗜殺園子的純化及其基園的克隆海洋嗜殺酵母的篩選、嗜殺因子的純化及其基因的克隆摘要通過人工感染實(shí)驗(yàn)確定了酵母菌WCY為梭子蟹的病原菌，感染實(shí)驗(yàn)的梭子蟹的癥狀同梭子蟹“乳化病”癥狀相同；通過形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，鑒定病原酵母菌WCY為梅奇酵母(Metschnikow

2、iabicuspidata)。從海洋中分離的327株酵母中篩選出13株對(duì)病原酵母WCY有抑制作用的嗜殺酵母，對(duì)其擲菌效果傲了比較，其中菌株YFOTo具有最佳的抑菌效果。通過生理生化和分子生物學(xué)方法對(duì)海洋嗜殺酵母進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示在海洋嗜殺酵母中，漢遜德巴利酵母(Debaryornyeeshansenii)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguflliermond$$)、醬魯蘭類酵母(Aureobasidiumpullulans)和異常畢赤酵

3、母(Pichiaanomala)最常見，其中異常畢赤酵母(Pichiaanomala)的抑菌能力最強(qiáng)。研究了菌株YF07b的嗜殺因子在不同NaCl濃度(O％，3％，6％，8％)、溫度(15，20，25，30，35℃)、pH(40，45，50，60，70，8O)值條件下的抑菌效果。嗜殺因子的最佳作用條件是NaCI濃度8％、pH為45，培養(yǎng)溫度為15℃。研究了菌株YF07b的發(fā)酵培養(yǎng)條件，結(jié)果表明當(dāng)海洋嗜殺酵母YF07b在溫度為20C，培養(yǎng)

4、基中NaCl濃度為2O％，pH為45時(shí)產(chǎn)生嗜殺因子的能力最強(qiáng)。分離篩選的海洋嗜殺酵母YF07b經(jīng)常規(guī)生理生化反應(yīng)和分子生物學(xué)鑒定，為異常畢赤酵母(Pichiaanomala)，根據(jù)陸地嗜殺酵母PichiaanomalastrainK的嗜殺因子(B1，3葡聚糖酶)的基因及相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物克隆菌株YF07b的嗜殺因子基因序列，克隆得到的基因序列為1559bp，GenBank登錄號(hào)為EF029071。與其它相關(guān)蛋白序列對(duì)比分析，確定此嗜殺因子

5、基因的編碼區(qū)(ORF框)為209bp到1492bp?？寺』虻耐茖?dǎo)蛋白為427個(gè)氨基酸，推導(dǎo)蛋白與其他酵母菌相關(guān)蛋白的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析比對(duì)，與異常畢赤酵母(PichiaanomalaStrainK)的親緣關(guān)系最近。信號(hào)肽分析結(jié)果表明。推導(dǎo)蛋白的前17個(gè)氨基酸為信號(hào)肽嗜殺因子經(jīng)SephadexG75凝膠過濾和DEAE—SephoroseFastFlow陰離子交換得到純化，經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)得到分子量為47kDa的單一條帶。純化后