刺五加多糖對K562白血病細胞的抑制作用.pdf

1、目的： 白血病(Leukemia)是一類造血干細胞的克隆性疾病，其克隆中的白血病細胞失去正常的成熟分化能力而停止在細胞發(fā)育的不同階段；并在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生聚集，浸潤其他組織器官，使正常造血功能受到抑制。在惡性腫瘤死亡率中，白血病居第6位(男)和第8位(女)，在兒童中則居第一位。急性粒細胞性白血病是成人白血病細胞的最常見類型，應用當代的治療方法大部分急?？梢酝耆徑?，但復發(fā)率較高。慢性粒細胞性白血病的死亡率在

2、東方國家特別是中國要高于西方國家，其慢性期一般約為3-4年，應用當代的治療方法仍有許多患者進入急性變期。因此，找到治療白血病的有效藥物和臨床治療的有效方法是一項長期艱巨的任務。 中藥刺五加為五加科植物(Acanthopanaxsenticos)的根和根莖，屬滋補性中藥。對刺五加具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、提高機體適應性和耐受性、抗衰老等藥理作用。最近由文獻報道刺五加多糖(Acathopanassenticosus polysaccha

3、rides．ASPS)具有抗腫瘤作用，包括調(diào)控腫瘤細生長、促進腫瘤細胞調(diào)亡、降低腫瘤細胞侵襲能力等，其主要通過提高機體免疫力和對腫瘤細胞直接的細胞毒作用來發(fā)揮抗腫瘤作用的。但至今對其分子機制仍缺乏了解。 本文主要檢測不同濃度刺五加多糖對k562細胞周期及凋亡率的影響，并檢測相關蛋白質(zhì)，如P21，Bax及Bcl-2的變化，從而探討刺五加多糖抑制k562細胞的有關分子機制。 方法： 1 細胞培養(yǎng)：將K562細胞用RP

4、MI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，內(nèi)含10％新生牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100μg/ml，置37℃，飽和濕度，5％CO<,2>環(huán)境下培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗操作。 2 MTT法檢測半數(shù)抑制率(IC<,50>)：分別測定不同濃度刺五加多糖對K562細胞48小時的抑制率。取對數(shù)生長期的細胞加到96孔板，參照刺五加多糖的血漿峰濃度分組，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物，培養(yǎng)48小時后，加入MTT。4．小時后棄去培養(yǎng)基加二甲

5、基亞砜，在490nm波長下檢測吸光值。根據(jù)吸光度A值計算細胞存活率(survival rate，SR)，計算公式為：細胞存活率(％)=用藥組A值/對照組A值×100％。根據(jù)各藥物SR，由藥物濃度的對數(shù)值與SR線性回歸求出K562細胞的藥物半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)。 3 熒光染色觀察細胞核形態(tài)改變：分別收集細胞，采用不同濃度的刺五加多糖作用K562細胞48h，同時設立空白對照組。將細胞用PBS洗后重懸，加入Hochest 3

6、3258熒光試劑0.5ml，吹打混勻，滴至載玻片上，蓋上蓋玻片。置熒光顯微鏡高倍鏡下計數(shù)400個細胞，觀察細胞核的形態(tài)學變化。 4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡：取對數(shù)生長期細胞加入采用不同濃度的刺五加多糖作用K562細胞，48h后收集細胞，70％乙醇4℃固定細胞24 h，50μg/ml PI染色30 min。流式細胞儀測定細胞周期，計算細胞周期分布及細胞增殖指數(shù)，檢測凋亡率并檢測凋亡相關基因Bax，Bcl-2蛋白的表達。 5

7、RT-PCR檢測p21、CyclinD1、Bcl-2、Bax、的表達：Trizol法提取細胞總RNA，采用隨機引物法以M-MLV合成cDNA，以特異的引物擴增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳后Goldview染色，圖像分析系統(tǒng)分析擴增條帶光密度值，以β-action為內(nèi)參，計算mRNA相對表達水平。 結(jié)果： 1 半數(shù)抑制濃度測定：k562細胞IC<,50>值為170μg/ml。 2 Hochest染色觀察加藥后細胞凋亡時

8、核形態(tài)變化：細胞凋亡后核固縮、染色質(zhì)固縮集聚、呈塊或碎裂狀改變。 3 流式細胞儀檢測結(jié)果：加藥K562細胞主要表現(xiàn)為G<,0>/G<,1>期細胞增多、G<,2>/M期細胞減少，說明加藥后的K562細胞較加藥前K562細胞增殖能力降低(P<0.05)；凋亡相關基因Bax蛋白的表達增高，Bcl-2蛋白的表達下降。 4 RT-PCR檢測p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2的表達：結(jié)果可見p21、CyclinD1、Bax