高壓氧對(duì)正常及SIRS大鼠脾T淋巴細(xì)胞的影響.pdf

1、前言：
　　 高壓氧作為一種治療手段,廣泛應(yīng)用于臨床。研究顯示高壓氧促進(jìn)傷口部位的纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血管的增生,促進(jìn)傷口愈合,增強(qiáng)細(xì)胞的殺菌能力,對(duì)特殊厭氧菌具有致命的殺傷力。在全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome,SIRS)狀態(tài)下,高壓氧的免疫調(diào)節(jié)作用,包括對(duì)T細(xì)胞的影響以及抗炎作用的研究尚不多見。SIRS從一個(gè)新的角度闡明多器官功能障礙綜合征(multiple

2、organ dysfunction syndrome,MODS)的重要病理生理及發(fā)生發(fā)展過(guò)程。經(jīng)過(guò)20余年的大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床資料揭示,創(chuàng)傷、感染、休克發(fā)展到MODS存在著一條共同通路,即SIRS。本實(shí)驗(yàn)以SIRS為基礎(chǔ),以免疫功能和炎癥反應(yīng)中具有代表性的脾T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象,研究高壓氧對(duì)正常機(jī)體以及SIRS時(shí)細(xì)胞免疫功能的影響,并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　 健康雄性SD大鼠

3、50只,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重約140～180g,隨機(jī)分為5組,每組10只。A組:腹腔注射等量生理鹽水(5ml/kg);B組:腹腔注射等量生理鹽水(5ml/kg),做3次高壓氧;C組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg);D組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg),做1次高壓氧;E組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg),做3次高壓氧。
　　 二、大鼠SIRS模型建立
　　 將酵

4、母多糖粉劑和無(wú)菌液體石蠟混合,高頻振蕩15分鐘,100℃水浴80分鐘滅菌,制成濃度為100 mg/ml的酵母多糖A-石蠟混懸液,存放于4℃?zhèn)溆?臨用前40℃水浴復(fù)溫,高頻振蕩15分鐘后注藥。大鼠實(shí)驗(yàn)前18小時(shí)開始禁食,不禁水。C、D、E組以500mg/kg體重給大鼠腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液,A、B組注射等量生理鹽水(5ml/kg)。
　　 三、高壓氧治療方案
　　 做1次高壓氧的時(shí)間為腹腔注射后4小時(shí),做3次高壓氧的時(shí)

5、間分別為腹腔注射后4小時(shí),10小時(shí),18小時(shí)。每次高壓氧都遵循以下方案:100％純氧洗艙5分鐘,以清除艙內(nèi)原有空氣。勻速加壓至2ATA(約10-15分鐘),用已校對(duì)的測(cè)氧儀測(cè)艙內(nèi)氧濃度達(dá)95％以上,期間以4L/min的速度持續(xù)通O2避免CO2蓄積,并將壓力維持在2ATA。1小時(shí)后以同樣速度勻速減至常壓,出艙。
　　 四、標(biāo)本采集及檢測(cè)
　　 腹腔注射24小時(shí)后,每只鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)定順序取脾,標(biāo)號(hào),脾臟剪至糊狀,100目篩濾過(guò)

6、(加PBS),離心1000rpm10分鐘,棄上清,低滲休克法溶解紅細(xì)胞,RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/ml。(1)取上述液體0.1ml。(2)4℃離心10分鐘,棄上清。(3)加入冷PBS1ml,輕輕震蕩,1000rpm4℃離心10分鐘,棄上清,重復(fù)2次。(4)加200 uL Buffer。(5)加10 uL AnnexinV-FITC。(6)加PI10uL,25℃,15分鐘。(7),加300uLBuffer30分鐘內(nèi)上流式細(xì)胞

7、儀測(cè)量。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 用SPSS13.0 for Windows軟件分析數(shù)據(jù)。各組數(shù)值用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,用F檢驗(yàn)做方差齊性檢驗(yàn),當(dāng)方差齊性相等時(shí),兩組間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差齊性不等時(shí)采用近似t檢驗(yàn)即t'檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、大鼠SIRS模型建立效果
　　 一般情況:腹腔注射酵母多糖-石蠟溶液組大鼠呼吸急促,伴有明顯喘鳴,皮膚粘膜發(fā)紺,

8、出汗,毛色灰暗,部分大鼠有鼻出血,腹脹,腹瀉。大鼠進(jìn)食明顯減少,活動(dòng)差,對(duì)外界刺激無(wú)反抗。大體改變:殺鼠后,見SIRS組大鼠腹腔滲出增多,腸管擴(kuò)張,程度不一;肝臟呈暗紅色或暗紫色;肺臟可見不同程度腫脹,部分可見充血出血點(diǎn);心臟,腎臟,脾臟,胰腺無(wú)明顯大體改變。
　　 二、高壓氧對(duì)正常大鼠脾T細(xì)胞的影響
　　 B組CD4+T細(xì)胞比例同對(duì)照組(A組)相比明顯減少(P＜0.01),CD8+T細(xì)胞基本無(wú)變化,CD3+CD4+/C

9、D3+ CD8+比值明顯下降(P＜0.05)。
　　 三、酵母多糖對(duì)脾T細(xì)胞的影響
　　 注射酵母多糖的大鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞均較對(duì)照組明顯減少(P＜0.01),減少程度基本平行,所以CD3+CD4十/CD3+CD8+無(wú)變化。
　　 四、高壓氧對(duì)SIRS大鼠脾T細(xì)胞的影響
　　 高壓氧使酵母多糖導(dǎo)致的CD4+T細(xì)胞減少明顯恢復(fù)(P＜0.05)。同高壓氧對(duì)正常大鼠T細(xì)胞的影響一樣,高壓氧幾乎不影響CD

10、8+T細(xì)胞,故CD3+ CD4+/CD3+CD8+比值升高(P＜0.05)。
　　 五、一次高壓氧和三次高壓氧對(duì)脾T細(xì)胞的不同影響
　　 D組和E組的CD4+和CD8+T細(xì)胞比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。也就是說(shuō),三次高壓氧治療對(duì)于CD4+T細(xì)胞的恢復(fù)并不比一次高壓氧治療具有更好的效果。
　　 結(jié)論：
　　 高壓氧特異性影響CD4+T細(xì)胞,對(duì)CD8+T細(xì)胞幾乎無(wú)影響。它可以使正常機(jī)體CD4+T細(xì)胞明顯減少,對(duì)SIRS