Toll樣受體4在嗜酸性粒細(xì)胞胃腸炎小鼠模型中的表達(dá)研究及藥物干預(yù)的觀察.pdf

1、研究目的：
　　嗜酸細(xì)胞性胃腸炎(Eosinophilic gastroenteritis,EG)是以胃腸道的某些部位彌漫性或局限性嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,Eos)異常浸潤(rùn)為特征的胃腸道疾，近年EG的發(fā)病率逐漸升高，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立卵清蛋白（ovalbumin,OVA）誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞胃腸炎（Eosinophilic Gastroenteritis,EG）小鼠模型，檢測(cè)EG小鼠血清中OVA特異性

2、IgE(OVA-sIgE)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（eotaxin,EOT）水平；同時(shí)，檢測(cè) EG小鼠胃、腸道組織的白介素5(interleukin5,IL-5)、γ-干擾素(Interferon-gamma,IFN-γ)、Toll樣受體4（toll-like receptor-4,TLR4）的表達(dá)水平，以研究EG可能的發(fā)病機(jī)制，從而探討TLR4在EG中的作用。在EG治療手段的探討方面，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素（強(qiáng)的松）、孟魯司特（順爾寧）、

3、蒙脫石（思密達(dá)）干預(yù)并觀察療效，為EG臨床用藥提供新的思路和途徑。
　　研究方法：
　　本實(shí)驗(yàn)分兩部分，第一部分：建立 EG小鼠模型；第二部分：應(yīng)用三種藥物干預(yù)并觀察療效。
　　第一部分實(shí)驗(yàn)：24只雌性，6周齡的Balb/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=8)、OVA處理組(n=8)、安慰劑組（n=8）。對(duì)OVA處理組小鼠處理：第1天，予OVA/Al(OH)3/生理鹽水（500ug/lmg/0.5ml）

4、基礎(chǔ)致敏1次；分別于第8天和第15天，予OVA/生理鹽水（500ug/0.5ml）強(qiáng)化致敏1次，第18-30天，予PLGA包裹的OVA/生理鹽水（lmg/8mg/0.3ml）隔日灌胃激發(fā)（共7次）；同時(shí)，予安慰劑組等量的佐劑行腹腔注射和生理鹽水灌胃。正常對(duì)照組不作特殊處理，正常喂養(yǎng)。3組小鼠于第31天處死，取外周血行 EOS計(jì)數(shù)；用ELISA法檢測(cè)血清OVA特異性IgE水平，取食管下段、胃竇、空腸、回腸和結(jié)腸組織，HE染色觀察其病理學(xué)變

5、化，以驗(yàn)證造模是否成功。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)：56只雌性，6周齡的Balb/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型1組、模型2組、強(qiáng)的松治療組、順爾寧治療組、思密達(dá)治療組、思密達(dá)預(yù)防組，每組8只。正常對(duì)照組不作特殊處理，正常喂養(yǎng)，模型1組處理同實(shí)驗(yàn)一的OVA處理組，模型2組經(jīng)致敏和激發(fā)后不作干預(yù)，正常喂養(yǎng)；強(qiáng)的松治療組經(jīng)致敏和激發(fā)后予強(qiáng)的松（3mg/kg）灌胃連續(xù)2周；順爾寧治療組經(jīng)致敏和激發(fā)后予順爾寧(1.5mg/kg

6、)灌胃連續(xù)2周、思密達(dá)治療組經(jīng)致敏和激發(fā)后予思密達(dá)（6g/kg）灌胃連續(xù)1周，思密達(dá)預(yù)防組經(jīng)致敏后予思密達(dá)（6g/kg）灌胃連續(xù)1周，再予OVA灌胃激發(fā)。各組小鼠均于處理24小時(shí)后處死，取外周血行Eos計(jì)數(shù)；用ELISA法檢測(cè)IgE、Eotaxin的含量；取食管下段、胃竇、空腸、回腸和結(jié)腸組織，HE染色觀察其病理學(xué)變化；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃腸組織TLR4、IL-5、IFN-γ的表達(dá)水平。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0進(jìn)行

7、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，對(duì)三組及以上的定量資料采用單因素方差分析及兩兩比較的LSD-t檢驗(yàn)，免疫組化評(píng)分用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、各組小鼠的臨床表現(xiàn)：
　　1.1、OVA處理組小鼠在致敏后均出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)減少、精神不佳、豎毛、弓背等表現(xiàn)，激發(fā)胃腸道過(guò)敏后其中6只小鼠排糊狀或水樣便、肛周沾糞，體重進(jìn)行性下降。正常對(duì)照組與安慰劑組小鼠毛發(fā)光澤,精

8、神良好,活動(dòng)正常。
　　1.2、模型1組小鼠表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)一OVA處理組相似。模型2組小鼠在停止激發(fā)1周后排成形大便，仍有精神不佳等表現(xiàn)，體重仍有下降趨勢(shì)。強(qiáng)的松治療組小鼠給藥2-4天后癥狀改善，表現(xiàn)較前活躍，1周后出現(xiàn)體重增長(zhǎng)。順爾寧治療組小鼠給藥1周后仍有懶動(dòng)、精神不佳等表現(xiàn)，體重仍有下降。思密達(dá)治療組小鼠給藥2、3天后排成形大便，余癥狀無(wú)明顯變化。思密達(dá)預(yù)防組小鼠致敏后均出現(xiàn)懶動(dòng)、精神不佳等表現(xiàn)，激發(fā)后有5只排糊狀或水樣便，伴體

9、重進(jìn)行性下降。
　　2、小鼠外周血Eos計(jì)數(shù)：
　　2.1、正常對(duì)照組、安慰劑組和OVA處理組的Eos計(jì)數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=7.859，P=0.030）。其中，正常對(duì)照組、安慰劑組 Eos計(jì)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.990），OVA處理組Eos較正常對(duì)照組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.032）。
　　2.2、正常組、模型1組和模型2組小鼠的外周血 Eos計(jì)數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=3.841，P=0.038）。其中，模型1組與模

10、型2組Eos計(jì)數(shù)無(wú)明顯差異（P=0.671），模型1組Eos計(jì)數(shù)較正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.029），模型2組Eos計(jì)數(shù)較正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.025）。藥物干預(yù)后,強(qiáng)的松治療組、順爾寧治療組、思密達(dá)治療組、思密達(dá)預(yù)防組小鼠的外周血Eos計(jì)數(shù)與模型1組、模型2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.237， P=0.944），各藥物組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.320，P=0.811）。
　　3、小鼠血清OVA-sIgE的水平：

11、
　　3.1、正常對(duì)照組、安慰劑組和OVA處理組小鼠血清OVA-sIgE水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.218，P=0.000），其中，正常對(duì)照組、安慰劑組小鼠血清OVA-sIgE水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.556），OVA處理組小鼠血清OVA-sIgE水平較正常對(duì)照組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。
　　3.2、正常對(duì)照組、模型1組和模型2組小鼠血清OVA-sIgE水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，（F=628.852,P=0.000），其中

12、，模型1組與模型2組小鼠血清 OVA-sIgE水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.053），模型1組小鼠血清OVA-sIgE水平較正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000），模型2組OVA-sIgE水平較正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。藥物干預(yù)后，模型1、2組和強(qiáng)的松治療組小鼠血清OVA-sIgE水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=60.464，P=0.000），其中，強(qiáng)的松治療組小鼠血清OVA-sIgE水平比模型1、2組低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.00

13、0）。順爾寧治療組、思密達(dá)治療組、思密達(dá)預(yù)防組小鼠血清OVA-sIgE水平與模型1、2組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.045， P=0.398）。各藥物處理組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=47.610，P=0.000）。其中，強(qiáng)的松治療組小鼠血清OVA-sIgE水平比順爾寧治療組*、思密達(dá)治療組**、思密達(dá)預(yù)防組***低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P*=0.000，P**=0.030，P***=0.037），順爾寧治療組、思密達(dá)治療組、思密達(dá)預(yù)防組OVA-sIgE

14、水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.126， P=0.343）。
　　4、小鼠血清Eotaxin的水平：
　　正常組、模型1組和模型2組小鼠血清 Eotaxin水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.705,P=0.000），其中，模型1組小鼠血清Eotaxin水平比正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000），模型2組小鼠血清Eotaxin水平比正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000），模型2組小鼠血清Eotaxin水平較模型1組低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

15、=0.000）。各藥物干預(yù)組小鼠血清 Eotaxin水平與模型1組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=230.09，P=0.000），強(qiáng)的松治療組*、順爾寧治療組**、思密達(dá)治療組***、思密達(dá)預(yù)防組****小鼠血清 Eotaxin水平比模型1組低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P*=0.000，P**=0.013，P***=0.046，P****=0.037），各藥物干預(yù)組小鼠血清Eotaxin水平與模型2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=3.778，P=0.064）。各藥

16、物組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.310，P=0.921）。
　　5、小鼠消化道組織病理：
　　實(shí)驗(yàn)一：OVA處理組小鼠的胃、空腸組織粘膜變薄、斷裂，下層充血，腺上皮脫落，均有嗜酸性粒細(xì)胞增多，不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而食管下段、回腸、結(jié)腸未見(jiàn)明顯異常。正常組和安慰劑組小鼠各段組織基本結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增多。
　　實(shí)驗(yàn)二：模型1組、2組小鼠胃、空腸組織病理改變與實(shí)驗(yàn)一的OVA處理組相似。強(qiáng)的松治療組小鼠胃、空腸粘膜

17、各層結(jié)構(gòu)基本正常,僅見(jiàn)輕微充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，EOS浸潤(rùn)程度較輕。順爾寧治療組、思密達(dá)治療組、思密達(dá)預(yù)防組的病理改變未見(jiàn)改善，與模型1、2組相似。
　　6、小鼠胃、空腸組織的IL-5、IFN-γ、TLR4表達(dá)水平：
　　6.1、正常對(duì)照組小鼠胃、空腸TLR4、IL-5、IFN-γ均有表達(dá)。
　　七組小鼠胃與空腸的IL-5水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（H=4272.515，P=0.637）；七組小鼠胃與空腸的IFN-γ水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差

18、異（H=2473.483，P=0.433）；七組小鼠胃與空腸的TLR4水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（H=374.328，P=0.827）。
　　6.2、IL-5：正常組、模型1組、模型2組和強(qiáng)的松治療組小鼠胃空腸IL-5水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=59.296，P=0.000），其中，模型1組*、模型2組**、強(qiáng)的松治療組***小鼠胃空腸 IL-5水平比正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P*=0.000， P**=0.000，P***=0.000）；強(qiáng)的松治

19、療組小鼠胃空腸IL-5水平比模型1組*、模型2組**低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P*=0.000，P**=0.000）；模型1組和模型2組小鼠胃空腸IL-5水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.401）。正常組、模型1組、模型2組和順爾寧治療組小鼠胃空腸IL-5水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=54.658，P=0.000），其中，模型1組*、模型2組**、順爾寧治療組***小鼠胃空腸IL-5水平比正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P*=0.000，P**=0.000，P***=

20、0.000）；順爾寧治療組小鼠胃空腸IL-5水平與模型1組*、模型2組**無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P*=0.267，P**=0.426）。正常組、模型1組、模型2組和思密達(dá)治療組小鼠胃空腸IL-5水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=45.293，P=0.000），其中，模型1組*、模型2組**、思密達(dá)治療組***小鼠胃、空腸的IL-5水平比正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P*=0.000，P**=0.000， P***=0.000）；思密達(dá)治療組小鼠胃空腸IL-5水平

21、與模型1組*、模型2組**無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P*=0.280，P**=0.828）。正常組、模型1組、模型2組和思密達(dá)預(yù)防組小鼠胃空腸IL-5水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=47.893，P=0.000），其中，模型1組*、模型2組**、思密達(dá)預(yù)防組***小鼠胃、空腸的IL-5水平比正常組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P*=0.000，P**=0.000，P***=0.000），思密達(dá)預(yù)防組小鼠胃、空腸的IL-5水平與模型1組*、模型2組**無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P*=

22、0.377，P**=0.658）。
　　6.3、IFN-γ：正常組、模型1組、模型2組和強(qiáng)的松治療組小鼠胃空腸IFN-γ水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.220，P=0.310）。正常組、模型1組、模型2組和順爾寧治療組小鼠胃、空腸IFN-γ的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.733，P=0.536）。正常組、模型1組、模型2組和思密達(dá)治療組小鼠胃、空腸IFN-γ的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.529，P=0.664）。正常組、模型1組、模型2組和思

23、密達(dá)預(yù)防組小鼠胃、空腸IFN-γ的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.632，P=0.597）。
　　6.4、TLR4：正常組、模型1組、模型2組和強(qiáng)的松治療組小鼠胃、空腸TLR4的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.974，P=0.429）。正常組、模型1組、模型2組和順爾寧治療組小鼠胃、空腸TLR4的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.677，P=0.610）。正常組、模型1組、模型2組和思密達(dá)治療組小鼠胃、空腸TLR4的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.742，

24、P=0.567）。正常組、模型1組、模型2組和思密達(dá)預(yù)防組小鼠胃、空腸TLR4的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.674，P=0.613）。
　　結(jié)論：
　　1、OVA作為過(guò)敏原，成功誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)過(guò)敏表現(xiàn)和在胃、空腸組織出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等相應(yīng)的病理變化。
　　2、EG模型小鼠血清OVA-sIgE呈持續(xù)性高水平表達(dá)；血清Eotaxin水平在疾病早期時(shí)相升高，而在持續(xù)階段有下降趨勢(shì)；EG模型小鼠胃、空腸組織的IL-5水平升高，

25、IFN-γ、TLR4表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　3、強(qiáng)的松治療可改善EG小鼠過(guò)敏表現(xiàn)和胃、空腸組織的炎癥病理改變；順爾寧、思密達(dá)處理后，EG小鼠的過(guò)敏表現(xiàn)和胃、空腸組織炎癥病理改變未見(jiàn)明顯改善。
　　4、強(qiáng)的松治療后， EG小鼠血清OVA-sIgE水平降低和胃、空腸組織IL-5的表達(dá)下調(diào)，對(duì)血清 Eotaxin水平和胃、空腸組織 IFN-γ、TLR4的表達(dá)無(wú)明顯影響；順爾寧、思密達(dá)處理后，EG小鼠血清OVA-sIgE、Eotaxi