芪丹通脈片含藥血清促血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟?。杭从捎诠诿}循環(huán)改變引起的冠脈血流和心肌需求之間不平衡導(dǎo)致的心肌損害,它的發(fā)病率和死亡率逐年增高,而且日趨年輕化，成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。PTCA（經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)）、CABG(冠脈搭橋手術(shù))等治療方法取得了滿意效果,但是一部分患者冠狀動脈纖細(xì)或病變彌漫,并不適合CABG或PTCA,而且存在費(fèi)用高、手術(shù)復(fù)雜及術(shù)后再狹窄等問題。Hockel等于1993年提出治療性血管新生的概念它指的是通過藥物基因或

2、其他方法促進(jìn)缺血組織血管新生，在原有微血管的基礎(chǔ)上長出新的毛細(xì)血管，與原有血管網(wǎng)相融合交匯，改善組織供血，提高心肌代償能力的一種方法。
　　中藥對血管新生有一定的作用。以中醫(yī)理論氣血相關(guān)學(xué)說為基礎(chǔ)，結(jié)合多年的臨床實(shí)踐建立起來的“芪丹通脈片”是治療缺血性心臟病的有效方劑，既往研究發(fā)現(xiàn)本藥有防治冠心病心肌缺血的作用，預(yù)防性給予芪丹通脈片可提高心肌缺血大鼠心室內(nèi)血管內(nèi)皮生長堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表達(dá)[1][2].為了明確該藥

3、在促進(jìn)血管新生及改善心功能方面的作用,本研究通過芪丹通脈片含藥血清作用于CAM.，在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)血管；采用流式細(xì)胞儀分析臍臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期；采用免疫組化分析臍靜脈內(nèi)皮細(xì)細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)。以從組織和細(xì)胞的層面探討益氣活血中藥的促血管生成作用機(jī)制，主要結(jié)果報(bào)告如下。
　　一、芪丹通脈片含藥血清對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響
　　目的：將芪丹通脈片含藥血清滴加到雞胚絨毛尿囊膜(CAM)上，觀察其對血管新生的影響。<

4、br>　　方法：8只SD大鼠，隨機(jī)分為2組，每組4只。藥物組每天每只大鼠按體重灌胃給予芪丹通脈片高劑量浸膏干粉混懸3.24g/(kg·d)，一日2次，每次2ml，正常血清組的大鼠按照正常食物、飲水飼養(yǎng),7d后腹主動脈取血，離心處理后，取血清將其置于-20℃冰箱中凍存取7日齡齡雞胚，隨機(jī)分組，每組10枚，用解剖刀啟開約直徑約1cm的窗口，暴露CAM，無菌膠帶封口繼續(xù)孵化。隔日，取定性濾紙作為載體置于CAM上，分別滴加含藥血清正常血清40u

5、L于載體上，對照組分別滴加40uL生理鹽水(NS)和bFGF，密封后繼續(xù)孵育72h，以甲醇和丙酮混合液(1：1)在室溫下固定，以載體為中心剪下CAM，展載體于濾紙上，[3-5]在解剖顯微鏡下以相同放大倍數(shù)計(jì)數(shù)血管，以實(shí)驗(yàn)部位邊緣lmm范圍內(nèi)為一級血管，以實(shí)驗(yàn)部位邊緣5mm處為二級血管進(jìn)行觀察分析，比較各組血管生成數(shù)目，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)淮差表示應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析比較各組間差異。
　　結(jié)果：解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)新生血

6、管數(shù)目。芪丹通脈片有明顯的促進(jìn)CAM血管新生作用,藥物組一級血管數(shù)29.17±2.99，二級血管數(shù)37.83±2.71與NS組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但與bFGF組比較,促CAM血管新生作用相對較弱(P<0.05)。
　　結(jié)論：芪丹通脈片有明顯的促進(jìn)CAM血管新生作用，其有效改善缺血心肌的血供以及治療缺血性疾病方面可能與其促進(jìn)血管新生有關(guān)。
　　二、芪丹通脈片含藥血清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響
　　

7、目的：在DMEM培養(yǎng)基中加入芪丹通脈片含藥血清作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用免疫組化分析VEGF的表達(dá)。
　　方法：制備含藥血清10只SD大鼠，隨機(jī)分為2組，隨機(jī)分為藥物組和生理鹽水組給藥劑量處理方法同實(shí)驗(yàn)一將HUVEC隨機(jī)分為3組：含藥血清組，正常血清組，陰性對照組,分別于DMEM培養(yǎng)液中加入,含藥血清，正常血清，陰性對照組,采用等量PBS加入培養(yǎng)基中作為對照將內(nèi)皮細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板每組4空加入0.82cm的蓋玻片。培養(yǎng)

8、細(xì)胞至融合后按不同分組給藥,再孵育24h后取出蓋玻片按試劑盒的免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法檢測VEGF表達(dá)。
　　結(jié)果：顯微鏡下,細(xì)胞胞核及細(xì)胞質(zhì)具有棕褐黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，對比正常血清組含藥血清組細(xì)胞邊界和核結(jié)構(gòu)清晰細(xì)胞核顏色深染，含藥血清＋阻滯劑組以及陰性對照組VEGF僅有微弱表達(dá)。
　　結(jié)論：芪丹通脈片能夠明顯促進(jìn)VEGF表達(dá),提示該藥物可能通過促進(jìn)VEGF表達(dá)而起到促進(jìn)缺血心肌的血管新生。
　　三、芪丹通脈片含藥血

9、清對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響
　　目的：在DMEM培養(yǎng)基中加入芪丹通脈片含藥血清作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖影響。
　　方法：制備含藥血清10只SD大鼠，隨機(jī)分為2組，隨機(jī)分為藥物組和生理鹽水組給藥劑量處理方法同實(shí)驗(yàn)一將HUVEC分為3組：含藥血清組，正常血清組，含藥血清＋阻滯劑組,分別加入各組的培養(yǎng)液，終濃度為150ML/L應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)淮差表示應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)

10、行單因素方差分析比較各組間差異。
　　結(jié)果：正常血清培養(yǎng)的HUVEC周期中G0/G1，期、S期及G2-M期細(xì)胞分布比例正常。含藥血清組G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，S期細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)含藥血清＋阻滯劑組較含藥血清組比較G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)，S期細(xì)胞數(shù)有所減少(P<0.05)。
　　結(jié)論：芪丹通脈片含藥血血清作用于內(nèi)皮細(xì)胞周期各時(shí)相的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比與對照組比較有明顯的不同