不同鋅源對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的生長(zhǎng)及對(duì)小腸上皮細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響.pdf

1、本試驗(yàn)以大鼠小腸上皮細(xì)胞IEC-6為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究了三種不同水平鋅源（納米氧化鋅、氧化鋅和硫酸鋅）對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌（ETEC，K88菌株）的生長(zhǎng)和在小腸上皮細(xì)胞上粘附的影響，及這三種鋅對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌侵染的小腸上皮細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。本研究共包括兩個(gè)試驗(yàn):
　　試驗(yàn)一、不同鋅源對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的生長(zhǎng)和粘附的影響
　　1、產(chǎn)腸毒性大腸桿菌在小腸上皮細(xì)胞上侵染模型的建立
　　在小腸上皮細(xì)胞（IEC-6，104個(gè)細(xì)

2、胞/孔）中分別添加5個(gè)不同水平（每孔中含0、1×102、1×104、1×106、1×108 CFU細(xì)菌）的產(chǎn)腸毒性大腸桿菌（ETEC，K88菌株），分別處理1.5、3、4.5h后測(cè)定CCK-8OD值。試驗(yàn)結(jié)果表明:所有濃度的產(chǎn)腸毒性大腸桿菌均能顯著降低IEC-6的CCK-8OD值（P＜0.05），并且具有時(shí)間和劑量效應(yīng)。本試驗(yàn)通過(guò)選擇1×106 CFU產(chǎn)腸毒性大腸桿菌處理組，確定感染復(fù)數(shù)（細(xì)菌與細(xì)胞的比值）為100，作為后續(xù)試驗(yàn)加入產(chǎn)腸

3、毒性大腸桿菌濃度的依據(jù)。感染復(fù)數(shù)為100，作用時(shí)間為3h時(shí)，細(xì)胞活力與對(duì)照組和1.5h處理組相比，均顯著下降，同時(shí)，此時(shí)大量細(xì)菌粘附在細(xì)胞周圍，細(xì)胞周圍未出現(xiàn)大量的空白區(qū)域。由此，建立了產(chǎn)腸毒性大腸桿菌在小腸上皮細(xì)胞上的侵染模型。
　　2、不同鋅源對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌生長(zhǎng)和在小腸上皮細(xì)胞上粘附的影響
　　分別在含有產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的培養(yǎng)液中添加0、6、12、24、48、96μmol/L的納米氧化鋅、氧化鋅和硫酸鋅，其中，對(duì)照組

4、為不加鋅的產(chǎn)腸毒性大腸桿菌處理組，總處理時(shí)間為24h，每隔1.5個(gè)小時(shí)測(cè)定一次吸光度。研究結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，6、12、24、48μmol/L納米氧化鋅處理組，所有濃度氧化鋅和硫酸鋅處理組，在處理時(shí)間為1.5h時(shí)，處理組吸光度均低于對(duì)照組（P＜0.05）。48、96μmol/L納米氧化鋅和96μmol/L硫酸鋅在24h時(shí)，與對(duì)照組相比吸光度顯著降低（P＜0.05）。所有濃度氧化鋅處理組在24h時(shí)的吸光度與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性的變化（

5、P＞0.05）。這說(shuō)明納米氧化鋅、氧化鋅和硫酸鋅在一定濃度均具有一定的抑菌作用，但鋅對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌生長(zhǎng)的影響主要是通過(guò)作用于產(chǎn)腸毒性大腸桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)段的結(jié)果。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入三種鋅與產(chǎn)腸毒性大腸桿菌連續(xù)作用24h后，并沒(méi)有出現(xiàn)顯著的抑菌圈，說(shuō)明三種鋅在連續(xù)作用24h后均沒(méi)有抑制產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的作用。這一結(jié)果也進(jìn)一步支持了以上結(jié)果。
　　與對(duì)照組相比，加入6μmol/L納米氧化鋅，6、12、24μmol/L的氧化鋅和硫

6、酸鋅對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌在IEC-6細(xì)胞上粘附的作用具有不同程度的促進(jìn)作用。而加入12、24、48、96μmol/L納米氧化鋅后，粘附在IEC-6細(xì)胞上的產(chǎn)腸毒性大腸桿菌數(shù)減少，其中，24、48、96μmol/L的納米氧化鋅顯著抑制了產(chǎn)腸毒性大腸桿菌在小腸上皮細(xì)胞上的粘附（P＜0.05）。
　　試驗(yàn)二、不同鋅源對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌侵染的小腸上皮細(xì)胞IEC-6免疫調(diào)節(jié)功能的影響。
　　添加6個(gè)不同水平（0、6、12、24、48、9

7、6μmol/L）的三種鋅源（納米氧化鋅、氧化鋅和硫酸鋅）和產(chǎn)腸毒性大腸桿菌（ETEC，K88菌株，感染復(fù)數(shù)為100）作用3h后測(cè)定緊密連接蛋白和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)量。以不添加鋅和產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的處理組為正常對(duì)照組，不添加鋅源的產(chǎn)腸毒性大腸桿菌處理組為陰性對(duì)照組。結(jié)果表明:添加產(chǎn)腸毒性大腸桿菌后，Claudin-1、 ZO-1和Occludin mRNA表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。與ETEC處理組相比，添加24μmol/L納米氧

8、化鋅后Claudin-1和Occludin mRNA表達(dá)量增加并達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。細(xì)胞用96μmol/L的納米氧化鋅處理后，ZO-1的基因表達(dá)水平顯著低于ETEC組（P＜0.05）。ETEC處理組與6、12、24、48μmol/L硫酸鋅處理組的Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA的表達(dá)量相比，沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。在添加量為24μmol/L時(shí)，納米氧化鋅處理組的Claudin-1和Occludi

9、n基因表達(dá)量顯著低于氧化鋅和硫酸鋅處理組。說(shuō)明24μmol/L的納米氧化鋅能顯著降低產(chǎn)腸毒性大腸桿菌誘導(dǎo)的緊密連接的破壞，且效果優(yōu)于氧化鋅和硫酸鋅;而加入量為96μmol/L時(shí)，則加速了緊密連接的破壞。ETEC處理組顯著升高了IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量（P＜0.05）。說(shuō)明加入產(chǎn)腸毒性大腸桿菌后誘發(fā)了腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。24μmol/L納米氧化鋅顯著降低了由ETEC誘導(dǎo)的IEC-6中IL-1β、TNF-α mRN

10、A表達(dá)量(P＜0.05)。當(dāng)加入濃度為96μmol/L時(shí)，IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA顯著高于ETEC處理組(P＜0.05)。添加6、12、24、48μmol/L納米氧化鋅和12、24、48、96μmol/L氧化鋅處理組顯著提高了TGF-β mRNA表達(dá)量（P＜0.05）。說(shuō)明適當(dāng)濃度的鋅能夠緩解由產(chǎn)腸毒性大腸桿菌誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，但高濃度鋅則加速了腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，同樣也說(shuō)明，細(xì)胞因子對(duì)三種鋅源的敏感度各不相同，這意味

11、著三種鋅在炎癥過(guò)程中的作用方式可能存在差異。
　　綜上所述:產(chǎn)腸毒性大腸桿菌對(duì)小腸上皮細(xì)胞IEC-6細(xì)胞活性的影響有時(shí)間和劑量效應(yīng)。當(dāng)感染復(fù)數(shù)為100，作用時(shí)間為3h時(shí)，可建立產(chǎn)腸毒性大腸桿菌在小腸上皮細(xì)胞IEC-6上的侵染模型。納米氧化鋅、氧化鋅和硫酸鋅對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用，并且這種抑制作用因加入鋅的存在形式、濃度和作用時(shí)間而存在很大的差異。當(dāng)加入96μmol/L，三種鋅對(duì)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌在小腸上皮細(xì)胞