腸上皮細(xì)胞來(lái)源的整合素αVβ6對(duì)樹突狀細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究背景：
　　 在臨床上新型抗生素被廣泛推廣應(yīng)用,新型的疫苗的研制也獲取了長(zhǎng)足的發(fā)展,我們?cè)谥委煾腥拘约膊〉姆矫嬉讶〉镁薮筮M(jìn)步,但是在過(guò)去的幾十年中,過(guò)敏性疾病的上升趨勢(shì)已明顯呈現(xiàn),食物過(guò)敏(food allergy,FA)以及相關(guān)疾病在全球范圍內(nèi)迅速增加,大約4％-8%的兒童和1%-2%的成年人對(duì)食物抗原具有IgE介導(dǎo)的高反應(yīng)性。食物過(guò)敏是以腸道口服耐受受損和Th2極化為特征的免疫反應(yīng)。許多免疫活性細(xì)胞參與其中如:調(diào)節(jié)性T細(xì)

2、胞(T regulatory cell,Treg)、樹突狀細(xì)胞(DC)、效應(yīng)性CD4+T和CD8+T細(xì)胞在腸道固有層聚集。Treg功能失常將導(dǎo)致過(guò)敏性疾病的發(fā)生,導(dǎo)致口服耐受(oral tolerance)受損和以Th2細(xì)胞為主的免疫反應(yīng),同時(shí)產(chǎn)生食物抗原特異性的IgE抗體,IgE與肥大細(xì)胞結(jié)合,并導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒釋放致炎因子,啟動(dòng)針對(duì)特異性抗原的過(guò)敏反應(yīng)。耐受型樹突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cell,Tol

3、DC)是一類未成熟樹突狀細(xì)胞亞型,高表達(dá)TGF-β或/和IL-10,但表達(dá)低水平共刺激分子,TolDC在Treg產(chǎn)生和口服耐受中起關(guān)鍵作用。在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,如腫瘤治療、抗微生物感染研究顯示,過(guò)繼轉(zhuǎn)移功能性修飾后的DC細(xì)胞能夠起到有效的免疫調(diào)節(jié)作用。腸道粘膜細(xì)胞特別是腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithelial cells,IEC),能夠促進(jìn)TolDC的分化。正常腸上皮細(xì)胞能夠增加DC細(xì)胞表達(dá)TGF-β,而TGF-β在維持D

4、C耐受表型中起重要作用TGF-β主要通過(guò)與TGF-β受體結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)免疫功能,可通過(guò)凋亡的方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
　　 整合素avβ6可結(jié)合在非活性(latent form)TGF-β的羧基末端的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid,RGD)序列上,從而使TGF-β更易于與其受體結(jié)合并進(jìn)一步形成活化TGF-β外泌體可作為細(xì)胞間信息傳遞、轉(zhuǎn)運(yùn)的載體,外泌體是由一些細(xì)胞分泌的直徑在30-1

5、00納米的小囊泡,由多囊泡體膜與細(xì)胞膜融合而生成。腸上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠攜帶細(xì)胞成分和攝入的蛋白質(zhì)成分,從而誘導(dǎo)腸道免疫反應(yīng)。卵清蛋白(ovalbvmin,OVA)抗原性穩(wěn)定可靠,是一種理想食物抗原模型。脂多糖是內(nèi)毒素,可引起了強(qiáng)烈免疫反應(yīng),促進(jìn)炎性細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子。IL-12p70是啟動(dòng)Th1反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子,DC在成熟的晚期和向T細(xì)胞遞呈抗原的早期,DC可分泌具有生物活性的IL-12p70,IL-12p70可誘導(dǎo)Th0向T

6、h1分化,啟動(dòng)細(xì)胞免疫,決定免疫激活還是免疫耐受。有研究顯示,腸上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠被DC捕獲并調(diào)節(jié)其自身功能一些物質(zhì)如整合素avβ6可能具有使DC產(chǎn)生耐受表型的能力,但這些分子是否能夠增加DC表達(dá)TGF-β仍有待進(jìn)一步研究。
　　 本研究是通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠腸上皮細(xì)胞和骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞,用卵清蛋白刺激腸上皮細(xì)胞后來(lái)源的外泌體與樹突狀細(xì)胞共同培養(yǎng),用來(lái)研究整合素avβ6對(duì)樹突狀細(xì)胞的影響,探討整合素avβ6是否能夠增加活化T

7、GF-β在DC中的表達(dá)并使之分化為TolDC,從而了解整合素avβ6在TolDC發(fā)生過(guò)程中的作用,并為后期研究提供理論依據(jù)。
　　 目的：
　　 通過(guò)分離培養(yǎng)BALB/c小鼠腸上皮細(xì)胞和骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞,OVA刺激腸上皮細(xì)胞,獲取外泌體,檢測(cè)整合素αvβ6的表達(dá),DC表面分子CDllc表達(dá),和DC在不同條件下進(jìn)行共同培養(yǎng),檢測(cè)DC細(xì)胞上清液中活化的TGF-β1和總TGF-β1細(xì)胞因子的水平和脂多糖刺激前后IL-12p7

8、0細(xì)胞因子的水平。探討腸上皮細(xì)胞來(lái)源整合素αvβ6對(duì)樹突狀細(xì)胞功能的影響。
　　 方法：
　　 培養(yǎng)BALB/c小鼠的腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell,IEC)和骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived DC,BMDC),腸上皮細(xì)胞在卵清蛋白刺激后,獲取外泌體,通過(guò)免疫磁珠分離出DC細(xì)胞。和DC細(xì)胞共同進(jìn)行培養(yǎng)分為5組:空白對(duì)照組、OVA組、外泌體組、外泌體+抗整合素α

9、vβ6抗體組及外泌體+羊抗小鼠IgG抗體組。進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。
　　 1.腸上皮細(xì)胞的病理檢測(cè)和CK-18的免疫組化檢測(cè)。
　　 2.免疫膠體金檢測(cè)外泌體的整合素αvβ6的存在。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面CDllc的表達(dá)。
　　 4.ELISA法測(cè)定不同干預(yù)條件下DC細(xì)胞上清液活化TGF-β1和總TGF-β1的分泌變化與脂多糖刺激前后的IL-12p70的分泌變化。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均錄入S

10、PSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析,比較各組間均值采用單因素方差分析,以α=0.05為假設(shè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.在體外的環(huán)境下,將小鼠骨髓細(xì)胞分離出來(lái),使用集落刺激因子和白介素4誘導(dǎo)BMDC分化為樹突狀細(xì)胞,通過(guò)免疫磁珠的分離,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樹突狀細(xì)胞特征性標(biāo)志CDllc,分離的細(xì)胞純度可達(dá)90%以上,并符合其特征。
　　 2.使用OVA刺激DC后,與空白實(shí)驗(yàn)組相比,總TGF-β1量明顯增加(226.

11、636±40.355vs176.947±23.072,P＜0.05),活化TGF-β1(43.322±13.479vs3.5.930±10.108,P＞0.05)無(wú)明顯變化。外泌體組與空白對(duì)照組相比,活化TGF-β1的量(80.532±26.167vs35.930±10.108,P＜0.05)和總TGF-β1(210.749±31.509vs176.947±23.072,P＜0.05)量明顯增加,而抗整合素aVβ6抗體組可以阻止這一現(xiàn)象

12、,作為對(duì)照抗體羊抗小鼠IgG組并不能改變此現(xiàn)象。
　　 3.細(xì)胞因子IL-12p70量的變化,在LPS刺激前,各組的分泌量無(wú)明顯的變化。在LPS刺激24小時(shí)后,OVA組和空白對(duì)照組相比較,分泌量(327.388±25.005vs348.015±17.272,P＞0.05)無(wú)明顯變化。外泌體組和空白對(duì)照組相比,分泌IL-12p70的能力明顯降低(145.804±11.690vs327.388±25.005,P＜0.05),抗整合素

13、αVβ6抗體組可以阻止這一現(xiàn)象,作為對(duì)照抗體羊抗小鼠IgG組并不能改變此現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：
　　 1.OVA和DC共培養(yǎng)后,總TGF-β1量的表達(dá)增加,而活化TGF-β1量無(wú)明顯變化。
　　 2.外泌體和DC共培養(yǎng)后,促進(jìn)總TGF-β1量和活化TGF-β1的表達(dá)上調(diào),抗整合素αVβ6抗體組可以阻止活化TGF-β1的表達(dá)上調(diào)這種變化,作為對(duì)照抗體羊抗小鼠IgG組并不能阻止此變化。
　　 3.脂多糖刺激DC