丹參預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注時葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78-94表達(dá)的影響.pdf

1、在肝臟外科及肝臟移植手術(shù)中，肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemiareperfusion injury, HIRI)是造成肝功能損害的重要因素，其損傷機(jī)制及臟器保護(hù)機(jī)理越來越受到人們的重視。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞中重要細(xì)胞器，主要參與蛋白質(zhì)合成、修飾和折疊，類固醇、膽固醇和其它脂質(zhì)生物合成和鈣離子貯存，同時是細(xì)胞內(nèi)其它膜性細(xì)胞器的重要來源，它在內(nèi)膜系統(tǒng)中占有中心地

2、位。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常敏感，缺血再灌注損傷會造成能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)自由基增多及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣超載，這些均可作為刺激因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。近年來，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose regulatedproteins，GRPs)在缺血再灌注損傷中所起的作用受到人們的關(guān)注。
　　 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，是細(xì)胞為適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)所產(chǎn)生的一類應(yīng)激蛋白

3、。GRP78，又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulinheavy chain binding protein，Bip)，在未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)信號傳導(dǎo)通路中處于核心地位，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)起始的標(biāo)志性分子。GRP94是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)數(shù)量最多的糖蛋白，可結(jié)合未折疊的多肽鏈，阻止蛋白質(zhì)聚集，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、伸展、組裝和轉(zhuǎn)運，抑制錯誤折疊蛋白質(zhì)的分泌。
　

4、　 丹參(radix salvia miltionrrhiza，RSM)是目前研究較多，效果較確切的活血化瘀類中草藥之一，它可以防止HIRI時肝臟細(xì)胞內(nèi)鈣超載、減輕氧自由基及脂質(zhì)過氧化損傷、保護(hù)細(xì)胞膜功能、阻斷Fas和穿孔素的交叉作用，協(xié)同bcl-2基因表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。既往認(rèn)為丹參的保護(hù)作用機(jī)理與其改善微循環(huán)、抗氧自由基、以及鈣阻滯作用有關(guān)，但尚未見報道過丹參的作用與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)系。本實驗研究的主要目的旨在了解大鼠肝缺血

5、再灌注期GRP78與GRP94的表達(dá)狀況及作用意義，以及丹參預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注期GRP78與GRP94表達(dá)的影響，迸一步認(rèn)識丹參肝保護(hù)作用的分子機(jī)制，為應(yīng)用丹參預(yù)處理防治肝缺血再灌注損傷提供依據(jù)。
　　 第一章、大鼠肝缺血再灌注時葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78/94的表達(dá)及意義
　　 目的：建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型，動態(tài)觀察肝缺血再灌注不同時限GRP78、GRP94、磷酸化蛋白激酶B1(p-Akt1)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白

6、酶12(cysteine-containing aspartate-specific proteases12，Caspase-12)的表達(dá)及作用意義。
　　 方法：
　　 1.健康Wistar雄性大鼠55只隨機(jī)分成3組:正常組(n=5)、假手術(shù)組(n=25)和缺血再灌注組(n=25)，假手術(shù)組與缺血再灌注組又根據(jù)再灌注后不同時限(0h、3h、12h、24h、72h)分為5個亞組，每組n=5。
　　 2.術(shù)前禁食1

7、2h，自由飲水。腹腔麻醉生效后，常規(guī)備皮、消毒，正常組進(jìn)腹后直接切取肝組織待測;假手術(shù)組僅解剖肝門;缺血再灌注組在肝十二指腸韌帶遠(yuǎn)心端安置無損傷動脈鉗鉗夾肝蒂45min，于不同復(fù)流時間(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝組織。肝組織一半置入10％福爾馬林固定，其余用無菌鋁薄紙包裝，放入液氮罐速凍，供檢測使用。
　　 3.HE染色及免疫組織化學(xué)均按試劑盒內(nèi)操作步驟進(jìn)行，兔抗大鼠GRP78多克隆抗體、兔抗大鼠GRP94多克隆

8、抗體及兔抗大鼠Caspase-12多克隆抗體的工作濃度為1∶100，均購自Santa Cruz公司。
　　 4.光鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察;免疫組織化學(xué)SABC法檢測GRP78、GRP94及Caspase-12在肝臟不同缺血時限的表達(dá)量，采用Image pro-plus6.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測。
　　 5.取出液氮罐存儲的新鮮肝組織，用免疫蛋白印跡法檢測p-Akt1表達(dá)量，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。兔抗大鼠p-Akt

9、1多克隆抗體購自Santa Cruz公司6.所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組樣本比較采用析因設(shè)計的方差分析（組間比較:方差齊采用LSD法，方差不齊采用Games-Howell法），以P＜0.05為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:正常組與假手術(shù)組的肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細(xì)胞呈多面體形，胞核大而圓，居中。缺血再灌注組0h時可見肝細(xì)胞輕至

10、中度水腫，肝竇間隙變窄;3h時肝細(xì)胞腫脹明顯，胞漿疏松化，部分出現(xiàn)嗜酸樣變;12h時彌漫性肝細(xì)胞腫脹，嗜酸樣變;24h時損傷最重，可見肝小葉變形，部分出現(xiàn)片狀壞死;72h時肝竇間隙狹窄減輕，肝小葉重構(gòu)。
　　 2.GRP78的表達(dá):陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，位于胞質(zhì)。正常組與假手術(shù)組表達(dá)較弱;缺血再灌注組GRP78的表達(dá)在各觀察時限點明顯高于以上兩組(P＜0.01)，其表達(dá)趨勢為:再灌注0～3 h表達(dá)開始上升，12h時達(dá)峰值(P＜0

11、.01)，24h仍處于相對高峰值，較正常組和假手術(shù)組高約一個數(shù)量級，較再灌注0h高約2倍，至再灌注72h，仍高于前述各組。
　　 3.GRP94的表達(dá):組間比較相同觀察時限點缺血再灌注組明顯高于另外兩組(P＜0.01)，表達(dá)趨勢為:再灌注0～3 h時表達(dá)明顯增強(qiáng)，在12h時達(dá)峰值(P＜0.01)，24h表達(dá)仍處于相對高峰值(P＜0.01)，較正常組和假手術(shù)組高約一個數(shù)量級，相對高于再灌注0、3h;至再灌注72h，仍高于正常組和假

12、手術(shù)組(P＜0.01)，與再灌注0h持平(P＞0.05)。
　　 4.Caspase-12的表達(dá):陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，位于胞質(zhì)。缺血再灌注各不同時限點Caspase-12表達(dá)明顯高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.01)，表達(dá)趨勢為:再灌注0h時即有較高表達(dá)，3h時顯著性高表達(dá)(P＜0.01)，于12h時達(dá)峰值(P＜0.01)，24h時表達(dá)雖有所降低，但仍遠(yuǎn)高于正常組與假手術(shù)組。再灌注72h時與0h持平，仍高于正常組和假手術(shù)組(P＜

13、0.01)。
　　 5.p-Akt1的表達(dá):p-Akt1在正常組及假手術(shù)組的表達(dá)較弱，在缺血再灌注組的表達(dá)顯著高于以上兩組，于再灌注0h～3h表達(dá)上調(diào)，12h時達(dá)峰值，24～72h時仍處于較高水平。
　　 小結(jié)：
　　 綜上所述，大鼠肝缺血再灌注損傷可觸發(fā)經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途經(jīng)的Caspase級聯(lián)反應(yīng)活化;GRP78與GRP94可能通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷和促進(jìn)糖異生而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，p-Akt1可能是此過程中機(jī)體通過PI3K

14、/Akt信號通路上調(diào)GRP78表達(dá)的重要信號分子。
　　 第二章、丹參預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注時葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78/94表達(dá)的影響
　　 目的：建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型，設(shè)立正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注組及丹參預(yù)處理組，動態(tài)觀察肝缺血再灌注不同時限GRP78、GRP94、p-Akt1及Caspase-12的表達(dá)特點，探討丹參在肝缺血再灌注期對以上指標(biāo)表達(dá)的影響及意義。
　　 方法：
　　 1.健康Wi

15、star雄性大鼠80只隨機(jī)分成4組:正常組(n=5)、假手術(shù)組(n=25)、缺血再灌注組(n=25)和丹參預(yù)處理組(n=25)，各實驗組再按肝缺血45min后不同再灌注時限(0h、3h、12h、24h和72h)分為五個亞組，每個亞組n=5。
　　 2.術(shù)前禁食12 h，自由飲水。腹腔麻醉生效后，常規(guī)備皮、消毒，正常組進(jìn)腹后直接切取肝組織待測，假手術(shù)組僅解剖肝門;缺血再灌注組在肝十二指腸韌帶遠(yuǎn)心端安置無損傷動脈鉗鉗夾肝蒂45min

16、，于不同復(fù)流時間(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝組織。丹參預(yù)處理組:丹參注射液（0.6g/kg）加生理鹽水至40ml/kg，術(shù)前尾靜脈推入，麻醉及手術(shù)方法同缺血再灌注組。肝組織一半置入10％福爾馬林固定，其余用無菌鋁薄紙包裝，放入液氮罐速凍，供檢測使用。
　　 3.HE染色及免疫組織化學(xué)均按試劑盒內(nèi)操作步驟進(jìn)行，兔抗大鼠GRP78多克隆抗體、兔抗大鼠GRP94多克隆抗體及兔抗大鼠Caspase-12多克隆抗體的工作濃

17、度為1∶100，均購自Santa Cruz公司。
　　 4.光鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)SABC法檢測GRP78、GRP94及Caspase-12在肝臟不同缺血時限的表達(dá)量，采用Image pro-plus6.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測。
　　 5.取出液氮罐存儲的新鮮肝組織，用免疫蛋白印跡法(Western-blot)檢測p-Akt1表達(dá)量，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。兔抗大鼠p-Akt1多克隆抗體購自Sant

18、a Cruz公司。
　　 6.所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組樣本比較采用析因設(shè)計的方差分析（組間比較:方差齊采用LSD法，方差不齊采用Games-Howell法），以P＜0.05為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:正常組與假手術(shù)組的肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細(xì)胞呈多面體形，胞核大而圓，居中。缺血再灌注組0h時可見肝細(xì)胞輕至中度水

19、腫，肝竇間隙變窄;3h時肝細(xì)胞腫脹明顯，胞漿疏松化，部分出現(xiàn)嗜酸樣變;12h時彌漫性肝細(xì)胞腫脹，嗜酸樣變;24h時損傷最重，可見肝小葉變形，部分出現(xiàn)片狀壞死;72h時肝竇間隙狹窄減輕，肝小葉重構(gòu)。相同時限點丹參組損傷程度較缺血再灌注組輕。
　　 2.GRP78的表達(dá):陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，位于胞漿。正常組與假手術(shù)組表達(dá)較弱;在相應(yīng)時限點，GRP78在缺血再灌注組的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);GRP78在缺血再灌注0h時

20、表達(dá)開始上升，在12h時達(dá)峰值(P＜0.01)，24h表達(dá)仍處于相對高峰值，較正常組和假手術(shù)組高約一個數(shù)量級，較再灌注0h高約2倍，至再灌注72h，仍高于前述兩組表達(dá)水平。在丹參預(yù)處理組，相應(yīng)再灌注時限點GRP78的表達(dá)均弱于缺血再灌注組(P＜0.01)。
　　 3.GRP94的表達(dá):陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，位于胞漿。正常組與假手術(shù)組表達(dá)較弱;在相應(yīng)時限點，GRP94在缺血再灌注組的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，表達(dá)趨勢為

21、:再灌注0～3h時表達(dá)明顯增強(qiáng)，在12h時達(dá)峰值(P＜0.01)，24h表達(dá)仍處于相對高峰值(P＜0.01)，較正常組和假手術(shù)組高約一個數(shù)量級，相對高于再灌注0、3h;至再灌注72h，仍高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.01)，與再灌注0h持平(P＞0.05)。在丹參預(yù)處理組，相應(yīng)再灌注時限點GRP94的表達(dá)均弱于缺血再灌注組(P＜0.01)。
　　 4.Caspase-12的表達(dá):陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，位于胞漿。Caspase-1

22、2在正常組與假手術(shù)組表達(dá)較弱;在缺血再灌注組0h～3h時即有較高表達(dá)，于12h時達(dá)峰值(P＜0.01)，24h～72h時表達(dá)有所降低，但仍遠(yuǎn)高于正常組與假手術(shù)組。在丹參預(yù)處理組，相應(yīng)再灌注時限點Caspase-12的表達(dá)均弱于缺血再灌注組(P＜0.01)。
　　 5.p-Akt1在正常組及假手術(shù)組兩組的表達(dá)較弱，在缺血再灌注組的表達(dá)顯著高于以上兩組，于再灌注0h時開始表達(dá)，12h時達(dá)峰值，24h～72h時仍處于較高水平。p-Ak