NgR特異性RNAi對(duì)EAE大鼠腦內(nèi)NgR表達(dá)、小膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘修復(fù)的影響.pdf

1、目的：多發(fā)性硬化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)常見的自身免疫性疾病,以慢性炎性脫髓鞘為主要病理改變。在青壯年發(fā)病率相對(duì)較高,其具體的發(fā)病機(jī)制不明,缺乏有效的特異性治療,具有較高的致殘率。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究多發(fā)性硬化常用的動(dòng)物模型,該模型在臨床、病理、生化等方面均能很好地模擬多發(fā)性硬化的發(fā)病過程。

2、Nogo受體(nogo receptor,NgR)是軸突再生抑制因子Nogo-A,髓鞘相關(guān)糖蛋白(Myelin-associated glycoprotein,MAG),少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(Oligodendrocyte MyeliN glycoprotein,OMgp)的共受體,因而在CNS損傷后軸突再生障礙中起重要作用。近來有研究表明在周圍神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型中,NgR可能可引導(dǎo)損傷部位巨噬細(xì)胞的清除,從而起到調(diào)節(jié)炎癥的作用。此外

3、,有研究表明在多發(fā)性硬化病人的腦組織中NgR的表達(dá)是增高的。這些都提示NgR在CNS免疫性疾病中可能具有免疫調(diào)節(jié)的作用。近年來,基因沉默技術(shù)中的短鏈RNA干擾(short interfefing RNAs,siRNAs)技術(shù)可高度特異性降解目的基因,且不引起非特異性干擾反應(yīng),因而對(duì)揭示某疾病中表達(dá)異常增高的基因或蛋白的功能是非常有用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常駐的單核吞噬細(xì)胞之一,其在功能及形態(tài)上與巨噬細(xì)胞具有許多相似之處,參與腦內(nèi)的

4、炎癥反應(yīng),并可能參與髓鞘的損傷與修復(fù)過程。因此,通過重組腺病毒為載體的NgR特異性shRNA轉(zhuǎn)染EAE大鼠腦組織,并觀察轉(zhuǎn)染前后小膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘的情況,可有助于闡述NgR在EAE中是否具有調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘再生的作用。
　　 本研究擬探討:1在EAE動(dòng)物模型中,NgR的的表達(dá)是否增高,以及小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量變化及激活等情況；2以重組腺病毒為載體的NgR特異性shRNA轉(zhuǎn)染EAE大鼠的側(cè)腦室,轉(zhuǎn)染后EAE大鼠腦組織NgR基因及蛋白

5、表達(dá)的變化,以及轉(zhuǎn)染后EAE腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及激活情況的變化；3該轉(zhuǎn)染對(duì)EAE大鼠臨床發(fā)病及腦組織炎性細(xì)胞聚集、髓鞘缺失情況的影響。從而揭示NgR.在多發(fā)性硬化中可能具有的調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘再生的作用。為闡明多發(fā)性硬化等中樞神經(jīng)免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù),并為其基因治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：1.建立Wistar大鼠EAE模型,運(yùn)用MRI掃描、HE染色、LuxolFast Blue染色等方法鑒定EAE模型

6、制備是否成功；通過免疫熒光染色觀察EAE腦組織中NgR表達(dá)是否上調(diào),以及巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量是否增加及其活化情況。
　　 2.應(yīng)用人胚腎293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒,采用賽多利斯腺病毒純化試劑盒純化、收集重組腺病毒,通過TCID50測(cè)定病毒滴度；用等體積的高、中、低滴度的重組腺病毒轉(zhuǎn)染EAE大鼠側(cè)腦室,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(green nuorescence protein,GFP)的表達(dá),采用HE染色觀察局部炎癥反應(yīng),從而

7、篩選出最佳的轉(zhuǎn)染滴度。
　　 3.用中滴度的Ad-shRNA-NgR、Ad-shRNA-HK分別轉(zhuǎn)染重組腺病毒載體Ad-shRNA-NgR干預(yù)組(特異性RNAi組)及重組腺病毒載體Ad-shRNA-HK干預(yù)組(陰性對(duì)照組),空白對(duì)照組以等量的PBS代替。在轉(zhuǎn)染后第7及14天取材,通過RT-PCR觀察轉(zhuǎn)染后腦組織NgRmRNA的表達(dá),免疫熒光染色觀察轉(zhuǎn)染后腦組織NgR蛋白的表達(dá)情況以及小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量變化及激活情況,行HE、Lux

8、ol Fast Blue染色以觀察炎性反應(yīng)、髓鞘缺失等組織病理學(xué)變化,并對(duì)各組大鼠的臨床轉(zhuǎn)歸進(jìn)行記錄。
　　 結(jié)果：1.所制備的EAE模型在MRI及病理學(xué)方面的改變符合經(jīng)典EAE表現(xiàn)。EAE腦組織中NgR的表達(dá)上調(diào),小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加,并以激活的小膠質(zhì)細(xì)胞為主。
　　 2.以GFP標(biāo)記了的重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染后第24～72小時(shí),熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):GFP表達(dá)逐漸增多。經(jīng)擴(kuò)增、純化后得重組腺病毒Ad-shRN

9、A-NgR及Ad-shRNA-Hk的滴度分別為:2.93×1010pfu/ml.2.84×1010pfu/ml。高、中、低滴度組EAE大鼠腦組織均出現(xiàn)GFP陽性表達(dá),且高、中滴度組轉(zhuǎn)染效率明顯高于低滴度組,但高滴度組與中滴度組的GFP表達(dá)無明顯差異。HE染色顯示,高滴度組大鼠腦組織轉(zhuǎn)染局部有明顯急性炎性反應(yīng),其余組轉(zhuǎn)染局部未發(fā)現(xiàn)明顯炎性反應(yīng)。
　　 3.轉(zhuǎn)染后第7天(d14):特異性RNAi組腦組織中NgR mRNA及蛋白的表達(dá)

10、明顯下降(p<0.01),小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)及髓鞘缺失情況與陰性及空白對(duì)照組未見明顯差異。轉(zhuǎn)染后第14天(d21):特異性RNAi組腦組織中NgR mRNA及蛋白表達(dá)仍低于空白及陰性對(duì)照組(p<0.01),但較該組轉(zhuǎn)染后第7天時(shí)有所增加(p<0.05)；小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較空白及陰性對(duì)照組多(p<0.05),且以活化狀態(tài)為主；髓鞘缺失的恢復(fù)較空白及陰性對(duì)照組好(p<0.05)。
　　 4.與空白及陰性對(duì)照組比較,特異性RNAi組大鼠

11、的發(fā)病潛伏期延長(zhǎng)(p<0.05)、臨床癥狀評(píng)分減輕(p<0.05)；d21時(shí)的髓鞘缺失緩解略明顯；d21時(shí),病灶部位內(nèi)的炎性細(xì)胞消退較慢。
　　 結(jié)論：EAE模型的制備是成功的。中滴度的腺病毒可高效、安全地轉(zhuǎn)染EAE腦組織。NgR特異性RNAi可明顯降低EAE腦組織中NgR基因及蛋白的表達(dá),并有利于髓鞘缺失的修復(fù),但對(duì)于激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的早期清除不利。該現(xiàn)象可能是通過病灶內(nèi)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞啟動(dòng)了髓鞘再生的修復(fù)機(jī)制,從而促進(jìn)髓鞘再