SHIV-XJ02170感染恒河猴后期傳代特點(diǎn)及其感染性克隆構(gòu)建和生物活性分析.pdf

1、在艾滋病的相關(guān)研究中,各種SHIV嵌合病毒及其動(dòng)物感染模型得到了廣泛的應(yīng)用。HIV B'/C亞型作為我國主要流行株之一,是疫苗研制的主要靶株,然而迄今為止,尚未出現(xiàn)有較強(qiáng)感染力、能引起中國恒河猴出現(xiàn)艾滋癥狀的此類SHIV。因此,構(gòu)建或獲得動(dòng)物適應(yīng)增強(qiáng)感染毒株,是建立針對(duì)性動(dòng)物模型的關(guān)鍵。SHIV-XJ02170毒株,是以致病性B亞型強(qiáng)毒株SHIV-KB9為骨架,攜帶了B'/C重組亞型HIV-1中國流行株的env基因。在前期研究中,雖然通

2、過一系列的猴體傳代,并未出現(xiàn)致病性強(qiáng)毒株,但是傳代猴A0408體內(nèi)的病毒在猴體長期適應(yīng)和傳代過程中,毒力有增強(qiáng)的趨勢(shì)。env基因的變異分析也發(fā)現(xiàn),病毒的基因距離出現(xiàn)明顯擴(kuò)大過程,且依照傳代的順序發(fā)生連續(xù)的基因進(jìn)化。
　　 本研究是在此工作基礎(chǔ)上,針對(duì)A0408(本實(shí)驗(yàn)編號(hào)G0401V)體內(nèi)長期適應(yīng)后已變異的SHIV-XJ02170病毒,進(jìn)一步開展猴體傳代和CD8+T細(xì)胞剔除研究,分析該病毒在動(dòng)物感染后期的傳代特點(diǎn)及其env基因的

3、變異情況,構(gòu)建出感染性全長克隆,并分別在細(xì)胞水平和猴體水平評(píng)價(jià)其活性。以期得到一株攜帶中國HIV-1流行株B'/C亞型基因、能感染中國恒河猴后誘發(fā)類艾滋癥狀的高致病性SHIV,并且在分子水平上探討病毒毒力增強(qiáng)的機(jī)制。
　　 將感染中國恒河猴G0401V后期(5年)的SHIV-XJ02170病毒垂直傳代2只猴(G0401V→G0402V→G0403V),同時(shí),剔除G0401V猴體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞使?jié)摲牟《敬罅繌?fù)制后傳代1只猴(

4、G0401V→G0404V),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、病毒載量測(cè)定、序列分析等方法研究該病毒在猴體內(nèi)長期適應(yīng)后的病毒學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)及序列變異特點(diǎn)。結(jié)果表明,G0401V在感染后期仍能穩(wěn)定傳代,且表現(xiàn)出病毒毒力增強(qiáng)的特點(diǎn)。其傳代猴G0402V在傳代后41d死亡,外周血CD4+T淋巴細(xì)胞衰竭,僅為43個(gè)/uL,符合艾滋病感染猴快速進(jìn)展型的特征。剔除G0401 V體內(nèi)CD8+T細(xì)胞之后的傳代猴G0404V的表現(xiàn)類似G0401V,即長期低水平的病毒血癥

5、水平。env基因序列分析發(fā)現(xiàn)SHIV-XJ02170在G0401V體內(nèi)長期適應(yīng)后發(fā)生了變異,并且各傳代猴中發(fā)生了不同進(jìn)化方向的變異,均伴隨糖基化位點(diǎn)的改變。
　　 為了進(jìn)一步了解病毒基因改變對(duì)毒力的影響,以及獲得發(fā)生變異后毒力增強(qiáng)的毒株,又進(jìn)行了感染性克隆的構(gòu)建等后續(xù)研究。首先構(gòu)建出以pCI-SphⅠ vector為載體、包含SHIV-KB9病毒全基因組的pSHIV-KB9-pCI全長克隆作為克隆骨架,以及包含SHIV-KB9病

6、毒3’端半長基因組的pSHIV-KB9-Eco47Ⅲ-3’半長克隆用于env基因的替換。從代表了SHIV-XJ02170病毒兩種變異方向的感染猴G0402V13d樣品和G0404V7d樣品中分別獲得病毒env區(qū)2.2kb的目的片段,替換掉SHIV-KB9的相應(yīng)部分后得到了四種不同序列的pSHIV-TC全長克隆。將這些克隆轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后收集到的病毒上清感染TZM-bl細(xì)胞,評(píng)價(jià)病毒的體外感染能力。其中來源于G0402V動(dòng)物的克隆株SH

7、IV-TC21的感染活性最強(qiáng),SHIV-TC22沒有活性；來源于G0404V動(dòng)物的兩個(gè)克隆株SHIV-TC41和SHIV-TC42的感染活性較弱。
　　 選擇細(xì)胞水平活性最高的感染性克隆SHIV-TC21進(jìn)行猴體水平的活性分析。動(dòng)物G0405V盛染后出現(xiàn)一過性的病毒載量和細(xì)胞免疫反應(yīng)。傳代后,病毒的毒力增強(qiáng),感染猴G0406V的病癥較為顯著,表現(xiàn)為:急性期較高的病毒復(fù)制水平,潛伏期維持較久的可檢出的病毒載量；由CD8+T細(xì)胞顯著

8、增多引起的外劇血CD4+/CD8+值明顯倒置,且長期維持在0.2附近:并伴隨慢性腹瀉的臨床癥狀。比較SHIV-XJ02170與其感染性克隆SHIV-TC21的猴體實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證明SHIV-TC21的毒力明顯強(qiáng)于親本株SHIV-XJ02170。
　　 綜上,通過對(duì)SHIV-XJ02170在一系列中國恒河猴體內(nèi)的傳代特點(diǎn)和病毒env基因序列的分析,初步探討了病毒毒力增強(qiáng)的分子機(jī)制:由此構(gòu)建出4個(gè)env基因序列不同的SHIV-TC感染性