急性缺血性腦損傷后Apelin神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)法制備大鼠腦急性缺血再灌注模型，利用apelin-13進(jìn)行超早期干預(yù)治療，觀察大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生率，caspase-3和caspase-12 mRNA表達(dá)的變化和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的變化情況，檢測新生神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量；探討apelin對急性缺血性腦中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：⑴實(shí)驗(yàn)動物

2、分組：取清潔級Wister成年雄性大鼠48只，隨機(jī)分成四組，每組12只；分別為空白對照組(blank groupⅠ組)；假手術(shù)對照組(sham group，Ⅱ組)；缺血再灌注組(ischemia reperfusion group，I/R，Ⅲ組)；缺血再灌注+Apelin干預(yù)組(ischemia reperfusion with apelin group，I/R+A，Ⅳ組)。⑵動物模型的制備：按0.3ml/100g體重，10％水合氯醛腹

3、腔注射麻醉，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)至頸總動脈分叉處，辨別并分離頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)；結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端，夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端。用自制處理過的尼龍線從頸外動脈剪口處插入，經(jīng)CCA進(jìn)入ICA，以頸總動脈分叉處開始計(jì)算，進(jìn)線深度為18.0±0.5mm，行至大腦中動脈起始部形成栓塞，造成局灶性腦缺血狀態(tài)。缺血30min/2h緩慢拔出尼龍栓子按預(yù)設(shè)時間再灌注后取材。⑶TTC染色：取各組手術(shù)成功大鼠行腹主動脈灌注TT

4、C染色，取腦查看各組大鼠腦梗死范圍和程度。⑷Apelin-13側(cè)腦室注射及給藥劑量：取第Ⅳ組MCAO造模成功的大鼠，側(cè)腦室內(nèi)微量緩慢注射10μl apelin。⑸Brdu摻入方法：大鼠腹腔注射Brdu(75mg/kg體重)，每天早晚各一次，連續(xù)注射三天，最后一次注射完2h后取腦。⑹石蠟切片，Brdu染色，免疫組化檢查新生神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)情況。⑺逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠損傷側(cè)大腦皮層caspase-3mRNA，

5、caspase-12mRNA，APJ表達(dá)的變化。⑻細(xì)胞凋亡測定：利用AnnexinV和PI雙染確定凋亡細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)。⑼大鼠腦缺血后氧化應(yīng)激功能的檢測：取大鼠腦組織勻漿液，測定MDA濃度，谷胱甘肽過氧化物酶濃度以及其總抗氧化能力。
　　 結(jié)果：①線栓法制備大鼠急性局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)，缺血2h/30min后再灌注；利用Zea-LongaV級評分標(biāo)準(zhǔn)對動物模型進(jìn)行評分，得分為2-3分的實(shí)

6、驗(yàn)動物為模型制備合格動物，經(jīng)TTC染色觀察梗死灶明顯，說明MCAO模型成熟穩(wěn)定，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。②免疫組化檢測結(jié)果顯示：腦缺血再灌注后在大腦皮層、紋狀體、側(cè)腦室區(qū)、蛛網(wǎng)膜下腔和海馬CA區(qū)都存在Brdu陽性表達(dá)的細(xì)胞；Apelin可明顯增加缺血腦區(qū)新生細(xì)胞數(shù)量。③RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：單純急性腦缺血再灌注后caspase-3mRNA在大腦皮層表達(dá)顯著升高，caspase-12mRNA的表達(dá)也明顯升高；Apelin干預(yù)后caspase-1

7、2mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，而caspase-3mRNA表達(dá)變化不明顯。④流式細(xì)胞儀測定：假手術(shù)組腦細(xì)胞凋亡率和空白組沒有明顯區(qū)別；單純腦缺血再灌注3h后細(xì)胞凋亡率顯著增高并持續(xù)增高，至腦缺血再灌注24h腦細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高峰，手術(shù)后48h開始降低，Apelin組缺血側(cè)腦區(qū)腦細(xì)胞凋亡率與對照組比較顯示降低趨勢，隨再灌注時間延長，差別明顯。⑤氧化應(yīng)激功能檢測：大鼠急性腦缺血再灌注后能顯著的降低谷胱甘肽過氧化物酶的活力，從而降低其總抗氧化能力

8、，造成氧自由基損害明顯，脂質(zhì)氧化加劇，產(chǎn)生MDA明顯增多。Apelin的干預(yù)明顯提高谷胱甘肽過氧化物酶的活性，提高其抗氧化能力(與單純?nèi)毖M比較P<0.01)。
　　 結(jié)論：⑴Apelin干預(yù)可能通過抑制凋亡因子caspase-12mRNA的表達(dá)而抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。⑵證實(shí)apelin能促進(jìn)腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的增殖，阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程，起到神經(jīng)保護(hù)作用。⑧Apelin超早期干預(yù)后能夠提高神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘

9、肽過氧化物酶的活性，降低脂質(zhì)氧化作用從而有效的提高組織的總抗氧化能力以對抗急性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用。⑶apelin-APJ系統(tǒng)在急性腦缺血再灌注損傷后具有神經(jīng)保護(hù)功能。其可能的作用護(hù)機(jī)制與apelin通過PI3K/akt通路等多種途徑發(fā)揮作用有關(guān)；實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Apelin-13通過誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化[1]對抗N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)興奮性毒性損傷，減少NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的堆積造成的細(xì)胞毒性作用，對