三疣梭子蟹CYP2和GST基因的cDNA克隆與表達分析.pdf

1、水產(chǎn)品藥物的殘留給人類健康和環(huán)境帶來了很大的危害。而藥物在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化離不開藥物代謝酶的參與，其活性的誘導或抑制會導致藥物的相互作用，從而影響藥物的殘留或影響藥效。已有研究表明生物體內(nèi)重要的藥物代謝酶有一相代謝酶細胞色素P450酶系（CYP450s）和二相代謝酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶系（GSTs）。然而，關于海洋甲殼動物中藥物代謝酶相關基因以及水產(chǎn)藥物對其表達水平和酶活性影響的研究卻非常少。本文以此為切入點，以我國重要的養(yǎng)殖蟹類-三疣梭子

2、蟹（Portunus trituberculatus）為研究對象，研究磺胺二甲嘧啶SM2、磺胺嘧啶SD和磺胺間甲氧嘧啶SMM等短、中、長三種磺胺類藥物對CYP2和GST基因表達以及酶活性的影響。為研究海洋甲殼動物藥物代謝酶基因的功能提供基礎數(shù)據(jù)，同時為磺胺類藥物在水產(chǎn)上的安全使用提供技術支持。本論文主要研究內(nèi)容共分為以下三部分：
　　第一部分：以三疣梭子蟹“黃選1號”為研究對象，通過簡并引物擴增及SMARTTM RACE擴增獲得三

3、疣梭子蟹細胞色素P450（CYP2）基因cDNA全長為1662bp（GenBank登錄號：KF781516），包含1479bp的開放閱讀框（ORF），編碼一個由492個氨基酸組成的多肽，預測理論等電點PI為6.348，分子量大小為56.68kDa。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列（ExxR）和血紅素結合區(qū)（FxxGxxxCxG）。同源性及系統(tǒng)進化分析表明，三疣梭子蟹 CYP2基因與岸蟹（Carcinus maenas）

4、和佛羅里達龍蝦（Panulirus argus）的同源性分別為75％和39%。熒光定量RT-PCR結果表明，CYP2基因在肝胰腺、鰓、心臟、肌肉、眼柄和血淋巴中都有表達。在肝胰腺中表達量最高（P<0.01），其次是鰓（P<0.01），在血淋巴中表達最少。本實驗用SM2、SD和SMM三種不同濃度磺胺藥物刺激三疣梭子蟹CYP2基因的表達，發(fā)現(xiàn)此三種磺胺藥物在CYP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上有影響，均可誘導肝胰腺中CYP2基因的表達。在SM2各劑

5、量組對CYP2基因的表達量不太顯著，只在高濃度組對其有顯著誘導效應（P<0.05）。SD和SMM各劑量組對CYP2基因的表達量有極顯著誘導效應（P<0.01），并且在SD各劑量組隨給藥劑量越大，CYP2基因上調(diào)水平越高，且出現(xiàn)的峰值越晚。結果表明，三種磺胺藥物可使 CYP2表達量升高，說明其對 CYP2有誘導作用，揭示了磺胺藥物與 CYP2酶的底物藥物合用時，很可能會發(fā)生藥物的相互作用，應適當調(diào)整用量，避免使藥物達不到療效。
　　

6、第二部分，克隆了三疣梭子蟹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因cDNA全長序列（登錄號：KF781517）。該基因全長1010bp，包含651bp的開放閱讀框（ORF），編碼一個由216個氨基酸組成的多肽，預測理論等電點PI為5.294，分子量大小為24.59kDa。氨基酸序列中含有GST基因家族特有GST-N結構域和GST-C結構域。同源性及系統(tǒng)進化分析表明，三疣梭子蟹GST基因與中華絨螯蟹（Eriocheir sinesis）和脊尾白蝦

7、（Exopalaemon carinicauda）的同源性分別為78%和63%。熒光定量 RT-PCR結果表明，GST在肝胰腺、鰓、心臟、肌肉、眼柄和血淋巴中都有表達，在肝胰腺中表達量最高（P<0.01），其次是鰓（P<0.01），在心臟中表達最少。本實驗用SM2、SD和SMM三種不同濃度磺胺藥物刺激三疣梭子蟹 GST基因的表達，發(fā)現(xiàn)此三種磺胺藥物在 GST mRNA轉(zhuǎn)錄水平上有影響，且呈現(xiàn)時間效應。在實驗的1、3、6h均呈現(xiàn)先小幅度升

8、高（P<0.01），這表明在外源藥物的刺激下生物體表現(xiàn)出一定的誘導作用，說明此誘導使生物體的解毒能力增加。隨著時間的延長在12和18h呈現(xiàn)下降趨勢（P<0.01），這表明隨著外源藥物的刺激，生物體GST表達量受到抑制作用誘導作用說明此時藥物已經(jīng)嚴重破了壞肝細胞的功能。在實驗的24和48h，實驗結果發(fā)現(xiàn)，GST基因的相對表達量急劇升高（P<0.01），這可能是生物體肝細胞的解毒功能得到恢復且其解毒能力更強。之后隨著時間的延長，藥物在體內(nèi)代

9、謝量逐漸降低，GST基因的相對表達量恢復至對照組。各藥物組在高濃度的脅迫下此反應趨勢更加明顯。
　　第三部分，研究了SM2、SD和SMM三種水產(chǎn)用磺胺類藥物對三疣梭子蟹肝胰腺組織中氨基比林N-脫甲基酶(APND)和GST活性的影響；結果表明，和對照組相比，三種磺胺類藥物對三疣梭子蟹肝胰腺S9中APND活性均具有誘導作用，其中SM2誘導效應最弱，只在實驗前期出現(xiàn)顯著誘導效應(P<0.05)。而其他兩種藥物出現(xiàn)極顯著的誘導效應(P<0