低氧對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響及機(jī)制探討.pdf

1、越來越多的證據(jù)表明損傷器官的修復(fù)不僅包括受損部位鄰近細(xì)胞的增值和遷移還包括其他部位干細(xì)胞的參與。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一類能增殖并分化為血管肉皮細(xì)胞的前提細(xì)胞，其特征性的表達(dá)CD34、KDR及CD133。研究表明EPCs在缺血組織的血管新生(revascularizatioa)及受損血管的再內(nèi)皮化(re-endothelialization)中起到了重要的作用。當(dāng)受到如缺血組織釋放

2、的各種細(xì)胞因子的刺激，內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓進(jìn)入血液循環(huán)(mobilization)，到達(dá)需要組織修復(fù)的部位或受損血管(homing)分化成為內(nèi)皮細(xì)胞(differentiation)，并釋放多種可以促進(jìn)局部內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖的細(xì)胞因子。EPCs移植在心血管疾病治療中有廣泛的應(yīng)用前景，其可以改善心肌梗死患者的心功能，減少心肌重塑，增加下肢缺血病人的運(yùn)動(dòng)耐量。 低氧與心絞痛，心肌梗死，心力衰竭及外周動(dòng)脈疾病密切相關(guān)，低氧和組織缺血多由

3、于血管閉塞或由于高血壓所致功能及解剖性微血管稀疏所致。降低的氧濃度刺激機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，例如內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，血管生成(angiogenesis)等，從而緩解局部缺氧。為適應(yīng)低氧刺激，細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子被激活，其中低氧誘導(dǎo)分子(Hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1)是細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境的關(guān)鍵信號(hào)分子。晚近研究表明，低氧微環(huán)境(如缺血組織，受損血管)通過HIF-1路徑刺激局部細(xì)胞釋放內(nèi)皮生長因子(Vascular

4、endothelialgrowthfactor，VEGF)及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(Stromalcell-derivedfactor-1α，SDF-1α)從而促進(jìn)EPCs的動(dòng)員及歸巢。但低氧微環(huán)境對(duì)EPCs遷移及凋亡的影響，目前還不清楚。 基于上述理論，我們提出假設(shè)：低氧可以影響EPCs的功能，繼而影響受損血管內(nèi)皮修復(fù)能力及血管生成，進(jìn)而影響一系列心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前國內(nèi)外有關(guān)低氧對(duì)EPCs功能的影響及其機(jī)制的研究尚很

5、少。為此，我們首先觀察了體外低氧對(duì)外周血EPCs功能的影響，隨后進(jìn)一步探討了低氧影響EPCs功能的可能機(jī)制。以下分兩部分對(duì)本研究的方法、結(jié)果以及結(jié)論作一簡述。 第一部分低氧對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響 目的： 觀察體外低氧對(duì)外周血EPCs功能的影響。 方法： 采用密度梯度離心法從人外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d，細(xì)胞同步化后放入低氧微環(huán)境(2％O2)干預(yù)。多波

6、長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志進(jìn)一步鑒定EPCs。采用改良的Boyden小室、MTT比色法、FITC-AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)、TUNEL染色法分別觀察EPCs的遷移能力、細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： 低氧24h能顯著增強(qiáng)外周血EPCs向SDF-1α(100ng/mL)的遷移能力。去血清48h，EPCs細(xì)胞活力明顯

7、下降，細(xì)胞凋亡明顯增多，低氧24h可以延緩去血清誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低，抑制去血清誘導(dǎo)的EPCs凋亡(與對(duì)照組比較，遷移能力58.57±10.49vs38.57±7.48，細(xì)胞活力0.74±0.13vs0.62±0.09，凋亡情況27.87％±2.03％vs32.43％±3.11％). 結(jié)論： 低氧可增強(qiáng)EPCs遷移能力，抑制EPCs活力下降及凋亡。 第二部分低氧對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響的機(jī)制探討 目的：

8、 研究低氧增強(qiáng)EPCs遷移及抑制其凋亡的機(jī)制。 方法： 采用密度梯度離心法從人外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiIacLDL雙染色陽性細(xì)胞為EPCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志進(jìn)一步鑒定EPCs。培養(yǎng)7d后，細(xì)胞同步化后，EPCs低氧培養(yǎng)24h干預(yù)或先予以磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase，PI3K)、

9、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellularsignalregulatedproteinkinase1/2，ERK1/2)抑制劑預(yù)處理1h后干預(yù)，RT-PCR檢測(cè)SDF-1α受體CXCR4mRNA的表達(dá)；流式細(xì)胞儀測(cè)定CXCR4表達(dá)率、改良的Boyden小室測(cè)量EPCs向SDF-1α(100ng/mL)的遷移能力。FITC-AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Westernblot檢測(cè)EPCsAkt、ERK1/2、GSK-3β

10、(Glycogensynthasekinase-3β)磷酸化水平及HIF-1α蛋白水平。采用MTT比色法觀察EPCs的活力。 結(jié)果： 低氧24h，EPCs向SDF-1α(100ng/mL)的遷移能力明顯增強(qiáng)，SDF-1α受體CXCR4mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，CXCR4特異性阻斷劑AMD3100和PI3K抑制劑(LY294002)可以近乎完全抑制增強(qiáng)的遷移能力，并且后者可以明顯抑制低氧誘導(dǎo)的CXCR4表達(dá)增高

11、，而ERK1/2抑制荊(PD98059)則對(duì)CXCR4的表達(dá)及EPCs的遷移能力沒有明顯作用。研究還發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑(LY294002)可以近乎完全的抵消低氧抑制的去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的EPCs活力下降及凋亡，而PD98059則無明顯作用。Westernblot檢測(cè)顯示低氧可以促進(jìn)EPCsAkt、ERK1/2、GSK-3β的磷酸化和HIF-1α蛋白水平的增加。 結(jié)論： 低氧可增加EPCs受體CXCR4的表達(dá)，抑制EPCs凋亡