乳腺癌生物學行為相關(guān)基因的臨床意義.pdf

1、前言：
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著婦女健康。盡管目前應(yīng)用的抗腫瘤綜合治療已經(jīng)很大提高了臨床療效，但這些治療仍不能有效的減少乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，及控制晚期乳腺癌的進展，而復發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療失敗和患者死亡的主要原因。近年來隨著腫瘤干細胞的研究進展，腫瘤干細胞被認為是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。乳腺癌干細胞作為異質(zhì)性的全體腫瘤細胞的產(chǎn)生源泉，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，侵襲轉(zhuǎn)移中起著極其重要的作用。從腫瘤干細胞的角度探討乳腺癌

2、發(fā)生發(fā)展和耐藥的機制和尋找治療策略的改進有著事半功倍的效果。
　　材料與方法：
　　一、病例組織標本
　　276乳腺癌標本來源于2003年1月-2006年12月年間就診于中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤外科和遼寧省腫瘤醫(yī)院并行乳腺癌根治手術(shù)治療的乳腺癌患者。均為女性患者，平均年齡45歲（25～76歲）。我們?nèi)〉昧嗣恳晃换颊叩臅嬷橥?，實驗通過了中國醫(yī)科大學倫理委員會的批準。標本滿足條件如下:
　　(a)患者經(jīng)過有

3、效手術(shù)治療;
　　(b)切除的乳腺癌組織經(jīng)過病理學檢測;
　　(c)手術(shù)后有至少15個淋巴結(jié)送病理確認;
　　(d)有完整的臨床病理資料，不符合上述條件的乳腺癌患者排除在外。
　　我們?nèi)〉昧嗣恳晃换颊叩臅嬷橥?，實驗通過了中國醫(yī)科大學倫理委員會的批準。
　　二、試劑
　　1)鼠源性單克隆抗人Oct4，Nanog抗體購自美國Abicom公司，正常山羊血清封閉液購自武漢博士德公司;
　　2）Ul

4、tra Sensitive TM S-P超敏濃縮試劑盒:Kit-0305，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;LI-9032/9033 DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。鼠源性單克隆抗人Nestin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，Nanog抗體購自美國Abicom公司，正常山羊血清封閉液購自武漢博士德公司;
　　3）Ultra Sensitive TM S-P超敏濃縮試劑盒:Kit-

5、0305，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;LI-9032/9033 DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
　　三、方法
　　組織中Nestin，Oct-4與Nanog蛋白的表達檢測應(yīng)用免疫組織化學(IHC)方法;CD44+/CD24-CSC分選采用免疫熒光抗體標記后流式細胞儀二次分選，CSC培養(yǎng)采用低粘附培養(yǎng)板下的無血清懸浮培養(yǎng);細胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine TM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行;TGF

6、-β處理細胞誘導細胞上皮間質(zhì)化(EMT);蛋白和mRNA表達檢測分別采用Western Blot和RT-PCR，細胞成瘤能力檢測采用C57BL/6SCID鼠成瘤試驗，細胞侵襲力檢測采用Trans Well的方法檢測。
　　四、統(tǒng)計學處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)。Nestin，Oct-4與Nanog的表達與臨床病例參數(shù)的相關(guān)性采用Pearson卡方檢驗或Fisher's確切概率法進行;總體生存期(Overa

7、ll survival,OS)及無病生存期(desease free survival，DFS)采用Kaplan-Meier方法計算，生存期組間比較采用log-rank檢驗;Cox regression模型單變量及多變量分析用于檢驗影響生存主要獨立危險因素;P＜0.05定義為有統(tǒng)計學意義
　　結(jié)果：
　　126例乳腺癌標本中Oct-4與Nanog的陽性表達率分別為41.27％(52/126)，36.51％(47/126)，其

8、中26(20％)例患者Oct-4與Nanog表達均為陽性。與陰性表達的患者相比，Oct-4(P=0.01)與Nanog(P=0.01)陽性表達的患者OS均較差，而且Oct-4與Nanog共表達的患者預后最差(P=0.001 Vs Oct-4-/Nanog-)。COX回歸模型分析發(fā)現(xiàn)Oct-4是影響乳腺癌預后獨立的獨立危險因素(P=0.003)。我們進一步檢測了Oct-4和Nanog共表達在維持乳腺癌干細胞EMT特性中的作用。我們發(fā)現(xiàn)沉默

9、Oct-4和Nanog后，CSC中N-cadherim，Vimentin，Slug，and Snail的表達顯著降低，E-cadherin和CK-18的表達顯著上調(diào)，相反，Oct-4和Nanog的過表達顯著的增加了N-cadherin，Vimentin，Slug，and Snail的表達，降低了E-cadherin和CK-18的表達。以上的這些改變在轉(zhuǎn)染后72小時更加明顯。流式細胞術(shù)結(jié)果表明，在TGF-β處理后，N-cadherinbr

10、ight E-cadherin-表型的EMT-樣CSC的比例明顯升高。我們進一步分離了TGF-β處理后N-cadherinbright E-cadherin-表型的EMT-樣和N-cadherindim E-cadherinbright非EMT樣CSC，比較了Oct-4和Nanog的mRNA表達水平。結(jié)果表明Oct-4和Nanog mRNA水平在EMT-樣CSC細胞中較非-EMTCSC顯著升高(p＜0.05 for both)。我們進一

11、步探測Oct-4 and Nanog的表達對于TGF-β誘導的CSC細胞EMT的重要性。CSC細胞同時沉默或同時過表達Oct-4和Naong，在轉(zhuǎn)染siRNA或過表達質(zhì)粒后24小時，細胞用TGF-β處理72小時，檢測N-cadherin，E-cadherin，CK-18，Vimentin，Slug，和Snail等的mRNA和蛋白表達水平。乳腺癌CSC中，Oct-4和Nanog同時沉默后，與未受刺激的細胞相比，TGF-β刺激導致細胞N-c

12、adherin，Snail的表達上調(diào)，E-cadherin和CK18表達水平下調(diào)，表明在Oct-4與Nanog共沉默的CSC中TGF-β仍可以誘導細胞EMT過程;有趣的是在Oct-4與Nanog共同高表達的CSC中，與未刺激的CSC細胞相比，TGF-β刺激后N-cadherin，Vimentin，Slug,和Snail的表到水平并未改變，但是E-cadherin和CK-18的表達水平輕微升高;這些結(jié)果表明乳腺癌CSC細胞中Oct-4和N

13、anog的表達對TGF-β誘導的EMT過程具有一定影響。表明Oct-4和Nanog高表達后細胞的侵襲力增加。我們采用免疫組化的方法檢測了150例三陰性乳腺癌患者腫瘤組織中Nestin的表達，結(jié)果表明癌組織中有41例(27.33％)患者癌細胞胞漿內(nèi)可檢測到Nestin的表達;進一步研究表明三陰性乳腺癌患者中，Nestin陽性表達的患者生存期較Nestin陰性的患者明顯縮短。我們探討了Nestin對乳腺癌干細胞致瘤性的影響，結(jié)果表明Nest

14、in+的乳腺癌干細胞致瘤性較Nestin-的乳腺癌干細胞強。較強的腫瘤形成能力往往與細胞的增殖力有關(guān)，于是我們進一步采用流式細胞術(shù)檢測了Nestin沉默后乳腺癌干細胞周期和凋亡的變化，與對照組相比Nestin沉默的乳腺癌干細胞G2/M期的細胞比例顯著增加，伴有死亡細胞比例的增加;同時Nestin沉默后凋亡細胞的比率較對照組明顯增加(43.53±4.78％vs.16.24±3.22％，p＜0.01)。因此，Nestin沉默后會誘導細胞周期

15、阻滯于G2/M，及促進細胞凋亡，這些結(jié)果迸一步證明Nestin促進乳腺癌干細胞的增殖及存活。為闡明Nestin影響乳腺癌干細胞侵襲遷移的機制我們采用Western blot的方法檢測了Nestin沉默后乳腺癌干細胞中EMT相關(guān)基因及調(diào)控基因的表達，結(jié)果表明，與對照組相比Nestin沉默后N-cadherin，Vimentin和α-SMA表達顯著下調(diào)，E-cadherin明顯增加;并且MMP2，MMP9及VEGF的表達也明顯下降;這些結(jié)果

16、表明Nestin沉默后抑制了乳腺癌干細胞自發(fā)EMT過程，其機制可能與迷亂性的激活Wnt/β-catenin通路有關(guān)。最后我們通過western blot的方法檢測了Nestin沉默后是如何影響GSK-3β的磷酸化水平，Nestin可能通過間接促進乳腺癌干細胞中GSK-3β的磷酸化進而提高Wnt/β-catenin通路活性。
　　結(jié)論：
　　Oct-4的表達與乳腺癌起源和生物學行為的關(guān)系已成為腫瘤研究過程中亟待解決的問題。通過

17、本研究提示Oct-4在乳腺癌中高表達，不但與乳腺癌的生物學行為密切相關(guān)，而且是乳腺癌的獨立預后因素。同時，TGF-β/Sma3與Oct-4/Nanog在促進乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有協(xié)同作用。
　　Nestin在一些三陰性乳腺癌組織中呈陽性表達并與患者的不良預后有關(guān)，而且，我們發(fā)現(xiàn)Nestin陽性的乳腺癌干細胞具有更強的體外克隆增殖能力及對裸鼠較強的致瘤性，敲除Nestin表達后抑制乳腺癌干細胞的增殖和侵襲力，誘導了細胞的凋亡;敲除