P120連環(huán)蛋白亞型三的磷酸化增強攜帶Kaiso出核促進肺癌細胞的侵襲.pdf

1、目的：
　　 Armadillo連環(huán)蛋白家族中的P120連環(huán)蛋白（p120-catenin，p120ctn）在胞膜與E-鈣（E-cadherin）結合可以調節(jié)鈣粘素的粘附力和穩(wěn)定性，在胞漿通過與小Rho GTPase的相互作用調節(jié)著細胞骨架的重構。近年來，大量研究表明p120ctn還穿梭于核漿，在核內解除轉錄抑制因子Kaiso蛋白對其下游候選靶基因matrilysin（MMP-7）、MTA2等的轉錄抑制作用。
　　 已有

2、大量的文獻報道了p120ctn的磷酸化狀態(tài)對E-cadherin和Rho GTPase的穩(wěn)定性有明顯的調節(jié)作用，而核內的p120ctn的磷酸化狀態(tài)對其功能具有什么樣的影響，尚無文獻報道。有研究表明p120ctn通過其入核定位信號（nuclear localization signal，NLS）和出核信號（nuclear export signal，NES）進出核，而Kaiso僅發(fā)現了一個入核定位信號NLS，尚未發(fā)現其出核信號NES。有研

3、究發(fā)現Kaiso無論在細胞漿，還是在細胞核的定位總是有p120ctn相伴隨。P120ctn的絲氨基酸288位的磷酸化（Phosphorylated serine 288，Ps288）又常常出現在核內，因此我們猜想p120ctn在核內的磷酸化狀態(tài)可能影響了與Kaiso的結合，Kaiso很可能是以與p120ctn結合的形式被帶出核的。
　　 我們在A549、H460等細胞系，通過轉染p120ctn相關質粒，并分別加入經典的出核途徑抑

4、制劑以阻止p120ctn的出核；加入相關藥物用以改變p120ctn蛋白分子上絲、蘇氨酸的磷酸化狀態(tài)，分別觀察了p120ctn和Kaiso蛋白的核、漿分布，探討了p120ctn核定位和磷酸化狀態(tài)對與Kaiso結合能力、Kaiso下游基因的轉錄以及細胞侵襲能力的影響。
　　 方法：
　　 1、細胞培養(yǎng)及處置
　　 所用的肺癌細胞系BE1和LH7為來自于PG肺大細胞癌細胞系（北京醫(yī)科大學陳杰教授饋贈）；肺大細胞癌NCI

5、-H460、NCI-H661，肺腺癌LTEP-a-2、SPC-A-1，肺鱗癌SK-MES-1，肺小細胞癌NCI-H446細胞系均購于中國科學院上海細胞庫：HBE為人永生化的正常支氣管上皮和肺腺癌細胞系A549購于美國。在37度無菌環(huán)境、10％的胎牛血清，5％的二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)。細胞的血清饑餓用含0.1％的DMEM，饑餓16小時；血清恢復用10％DMEM，恢復30分鐘；萊普霉素B處置劑量50nM，時間為18小時；PMA應用劑量200n

6、M，作用時間為30分鐘；BisI的施用劑量為1μM，時間為10分鐘。
　　 2、質粒構建和轉染
　　 Mp120-1A、mp120-3A模板由美國Vanderbilt大學細胞生物學教研室構建的，由Reynolds B.Albert教授饋贈。P120-NLS-1A、3A質粒為在mp120-1A、3A的基礎上構建的強制入核質粒，用PCR的方法擴增了原質粒中的P120-1A、3A全長基因，酶切PCR產物及載體質粒pCMV/my

7、c/nuc/GFP，將全長基因連接到pCMV/myc/nuc/GFP載體相應的酶切位點上。提取質粒并送大連TaKaRa生物公司測序。pBluescript-Kaiso質粒是由加拿大Mcmaster大學生物學教研部門構建，由Juliet M.Daniel教授饋贈。由TaKaRa生物公司合成的人類P120總siRNA序列如下：A：5’-GGATCACAGTCACCTTCTA-3’：5’-TAGAAGGTGACTGTGATCC-3B：5’-G

8、CACTTGTATTACAGACAA-3’：5’-TTGTCTGTAATACAAGTGC-3’C：5’-GGATAACAAGATTGCCATA-3’：5’-TATGGCAATCTTGTTATCC-3’用轉染試劑Lipofectamine 2000參照操作說明書完成瞬時及穩(wěn)定轉染細胞系構建。
　　 3、免疫熒光
　　 轉染24小時后，轉染的細胞經過固定、打孔、封閉后加入P120鼠單抗（1:200），Kaiso羊多抗（1:1

9、00），Kaiso鼠單抗（1:200），Ps288鼠單抗（1:200），濕盒中4度中孵育過夜。一抗孵育完畢，于暗室中加入二抗，抗鼠二抗FITC（1:100）、抗羊二抗TRITC（1:100）、Hoechst（1:200）。最后用熒光顯微鏡觀察并照相。
　　 4、核漿蛋白的分離、免疫共沉淀和Wrestern-blot
　　 參照核漿蛋白試劑盒操作說明書進行核漿蛋白抽提?？偟鞍准昂藵{抽提的蛋白用Bradford法測其濃度。免

10、疫共沉淀的總蛋白經過加入誘餌抗體孵育、Protein G microbeads孵育后，分離并收集其免疫復合物。樣本可以進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉印到PVDF膜上。5％的脫脂奶粉或5％的BSA搖床上封閉后，加入一抗p120單抗（1:800），Ps288單抗（1:500），kaiso單抗（1:400），內參Actin（1:400），LaminB1（1:400），Tubulin（1:200），4度孵育過夜。取出孵育后的膜用相應二抗（1

11、:4000.1:8000）室溫孵育2小時后于暗室進行ECL顯色。
　　 5、RNA提取和反轉錄多聚酶鏈反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）
　　 用TRIzol Reagent提取細胞總的RNA。用RNA PCR試劑盒依照說明書進行目的片段的擴增。用1.5％的瓊脂糖膠并加入了0.1μg/μl的溴化乙腚電泳。相對RNA的量是用目的條帶與β-ac

12、tin的條帶相比得出的值。
　　 6、Transwell基質膠細胞侵襲試驗
　　 用無血清的培養(yǎng)基將Matrigel以1:5稀釋后加入到孔徑為8.0μm的tranwell小室中，向小室的上室中加入100μl的細胞懸液（5×105 cells/ml），下室中加入含10％FBS的血清作為趨化誘導劑，孵箱中孵育48小時后取出，用無菌的棉簽擦拭去上室的膠，濾膜經固定、染色后封片，鏡檢10個高倍視野（400x）。
　　 7

13、、統計分析
　　 每個試驗驗證了三次，所有組別之間的統計分析用的是SPSS11.5，Western-blot和RT-PCR的灰度值分析用的是方差分析LSD檢驗，當P<0.05認為差異有統計學意義。
　　 實驗結果：
　　 1、Western-blot結果顯示：肺癌細胞及正常支氣管上皮HBE僅表達p120ctm 1、3亞型；核漿蛋白抽提后發(fā)現：相應細胞核漿中均有二個亞型的表達：免疫共沉淀發(fā)現：僅p120ctn 3亞

14、型可以沉降下來Kaiso，p120ctn 1 亞型卻未能成功沉降Kaiso。
　　 2、核漿蛋白抽提后Western-blot結果顯示：過表達p120ctn 3亞型（p120-3A）后，與空轉染組相比出現了細胞漿中Kaiso的量增加（P<0.05），細胞核中的量減少（P<0.05）的現象；而過表達p120ctn 1亞型（p120-1A）Kaiso的核漿表達量與空轉染組相比沒有明顯變化（P>0.05）。
　　 3、施加萊普

15、霉素后核漿蛋白抽提、Western-blot的結果顯示：施加萊普霉素的過表達p120-3A與未施加的相比，部分p120ctn 3亞型被阻滯于細胞核內（P<0.05），同時Kaiso的核漿再分布也被終止。萊普霉素也同樣阻滯了部分p120-1A的出核，但對于Kaiso的核漿分布沒有影響。
　　 4、RT-PCR結果顯示：過表達Kaiso后，Kaiso下游候選靶基因MMP-7和MTA2明顯下調（P<0.05）；過表達p120-1A和p

16、120-3A均上調了MMP-7和MTA2的mRNA水平（P<0.05），但過表達p120ctn 1亞型上調的程度強于過表達p120ctn 3亞型。
　　 5、應用饑餓誘導，PMA及其抑制劑BisI處理細胞后核漿蛋白抽提、Western-blot檢測結果顯示：p120ctn 3亞型的絲氨基酸的288位點饑餓誘導磷酸化后增強了與Kaiso蛋白的結合，并增強Kaiso的出核量，同時增強上調MMP-7和MTA2的mRNA水平；PMA誘導

17、288位點的去磷酸化可以逆轉上述作用。
　　 6、免疫熒光F-actin染色和基質膠侵襲transwell實驗結果顯示：p120蛋白的入核和絲蘇氨基酸位點的磷酸化均可以促進肺癌細胞伸出偽足和形成侵襲邊緣，磷酸化后穿入transwell小室的癌細胞明顯增多（P<0.05）。
　　 結果：
　　 1、核漿穿梭的p120ctn 3亞型與核漿穿梭的Kaiso直接結合
　　 2、核漿穿梭的p120ctn 3亞型協助