CD40單克隆抗體活化DC疫苗誘導(dǎo)CTL對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的免疫治療研究.pdf

1、研究背景：結(jié)腸癌是臨床常見腫瘤，肝臟轉(zhuǎn)移已成為結(jié)腸癌患者死亡的主要因素。目前，針對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療方法主要包括手術(shù)(栓塞、射頻消融)、放療、化療等，但單一方法均不能有效地逆轉(zhuǎn)患者的荷瘤狀態(tài)，故結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移以綜合治療為主，而近年來作為結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移綜合治療方法之一的過繼細(xì)胞免疫療法(ACI)日漸受到人們的關(guān)注。國(guó)內(nèi)外最新研究表明，激動(dòng)型CD40單克隆抗體(CD40mAb)可逆轉(zhuǎn)腫瘤的免疫抑制、增強(qiáng)DCs介導(dǎo)的T細(xì)胞抗腫瘤作用。然而，將

2、激動(dòng)型CD40單克隆抗體應(yīng)用于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移過繼細(xì)胞免疫治療，以增強(qiáng)細(xì)胞免疫治療效果的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　研究目的：應(yīng)用激動(dòng)型CD40單克隆抗體誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)，研究其增強(qiáng)腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的體外殺傷及對(duì)小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的免疫治療作用。
　　研究方法：1)通過脾包膜下注射法，將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26注射至小鼠脾臟包膜下構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。2)取正常小鼠脾臟，以小鼠淋

3、巴細(xì)胞分離液分離和提取小鼠淋巴細(xì)胞，貼壁細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞分別誘導(dǎo)培養(yǎng)；貼壁的DCs以小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞裂解產(chǎn)物負(fù)載，培養(yǎng)過程中用或不用小鼠激動(dòng)型CD40單克隆抗體(CD40mAb)激活DCs成熟。3)成熟的DCs與同源的未貼壁細(xì)胞共育，加入細(xì)胞因子，分別獲得CTLCD40Ab和CTL。4)培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)和活性，細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)各組CTLs增殖情況，LDH法檢測(cè)各組CTLs對(duì)小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的體外殺傷，分析各組殺傷效果。

4、5)連續(xù)尾靜脈注射生理鹽水、CD40mAb、CTLCD40Ab和CTL(1次/周，共3次)對(duì)小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行治療，分析抑瘤效果。
　　研究結(jié)果：1)成功構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，成瘤率86.7％(13/15)，病理結(jié)果符合結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移特點(diǎn)。2)光鏡觀察CTLCD40Ab的細(xì)胞數(shù)量和集落較CTL細(xì)胞為多，且細(xì)胞密度、單細(xì)胞體積更大；細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，CTLCD40Ab細(xì)胞較CTL細(xì)胞增殖明顯，其中以CTLCD40Ablug/ml

5、細(xì)胞增殖最為明顯。3)10:1效靶比下，CTLCD40Ablug/ml、CTLCD40Ab5ug/ml及CTL組細(xì)胞對(duì)小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的殺傷率分別為65％、53％和29％，且CTLCD40Ablug/ml和CTLCD40Ab5ug/ml組殺傷率較CTL組顯著增高(P<0.05)。4)體內(nèi)抑瘤顯示：CD40Ab組、CTL組和CTLCD40Ag組抑瘤率分別為(23.1±12.5)％、(53.8±9.8)％和(64.6±10.2)％；

6、與對(duì)照組小鼠瘤重相比，CTL和CTLCD40Ag組小鼠瘤重顯著降低(P<0.05)，CTLCD40A組較CD40Ab組亦顯著降低(P<0.05)，而CTL組和CTLCD40Ag組之間，以及CTL組和CD40Ag組之間瘤重?zé)o顯著差異(P=0.089；P=0.077)；組織病理切片示，CTL和CTLCD40Ag治療組小鼠腫瘤區(qū)域有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　研究結(jié)論：1)本研究制備的小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型致瘤率高、安全穩(wěn)定，真實(shí)的模擬了人結(jié)

7、腸癌肝臟轉(zhuǎn)移病理過程，且制備技術(shù)簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)，對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)與臨床研究有較好的應(yīng)用價(jià)值。2)激動(dòng)型CD40Ab在體外可活化和激活腫瘤抗原負(fù)載DCs，并通過活化的DCs作用于T細(xì)胞，從而顯著增強(qiáng)腫瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)的增殖活性和在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。3)在體內(nèi)，通過激動(dòng)型CD40Ab活化腫瘤抗原負(fù)載DCs并進(jìn)而制備的腫瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)可顯著抑制小鼠肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長(zhǎng)，且激動(dòng)型CD40A