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文檔簡(jiǎn)介
1、中國(guó)柿在長(zhǎng)期栽培過(guò)程中,由于遺傳變異和自然、人工選擇的作用,分化出了許多寶貴的甜柿資源。本研究對(duì)部分柿屬雄性種質(zhì)及甜柿種質(zhì)采用RAPD、ISSR等分子標(biāo)記分析,結(jié)合對(duì)新發(fā)現(xiàn)原產(chǎn)中國(guó)大別山區(qū)雄性種質(zhì)花粉基礎(chǔ)生物學(xué)研究,建立和優(yōu)化柿屬植物ITS-PCR及AFLP技術(shù)體系,對(duì)部分柿屬雄性種質(zhì)間親緣關(guān)系、系統(tǒng)演化及遺傳多樣性進(jìn)行了分析比較,探討柿屬雄性種質(zhì)在中國(guó)原產(chǎn)甜柿起源演化中可能的作用。主要結(jié)果如下: 1.12份供試雄性種質(zhì)花粉萌芽
2、率在20.1%-38.5%之間;除臺(tái)灣正柿及油柿外,其余試材的花粉均能在羅田甜柿的柱頭上萌發(fā);雄株2號(hào)、雄株3號(hào)、雄株8號(hào)不含巨大花粉,其余試材有0.18%-4.44%不同比例的巨大花粉存在。 2.對(duì)29份柿屬雄性種質(zhì)RAPD分析結(jié)果如下:從118條隨機(jī)引物中篩選得到32條引物,共擴(kuò)增得到499條譜帶,平均多態(tài)性比率87.17%,26個(gè)種質(zhì)特異性標(biāo)記,平均多態(tài)性信息含量為0.6097。3種方法(UPGMA法,ME法,Wagner
3、 簡(jiǎn)約法)聚類分析表明:中國(guó)柿種質(zhì)與日本柿種質(zhì)明顯聚為2個(gè)類群,甜柿與澀柿不能截然分開(kāi);完全雄性資源同羅田甜柿親緣關(guān)系密切;湘西甜柿和日本甜柿關(guān)系密切,寶蓋甜柿和磨盤柿(羅田)親緣關(guān)系密切;3種聚類方法結(jié)果基本聚類分組結(jié)果類似,同時(shí)也存在極少數(shù)差異;主成分分析和主坐標(biāo)分析支持聚類分析結(jié)果。 3.建立了適合柿屬植物的ISSR分析技術(shù)體系:25μL反應(yīng)體系中,含l×Buffer,Mg<'2+>2.0或2.5mmol/L,dNTPs
4、 0.2mmol/L,引物0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,甲酰胺2%,模板DNA 2.4ng/μL;PCR擴(kuò)增程序:94℃變性3min;94℃30s,(Tm+2)℃(根據(jù)引物不同設(shè)定)45s,72℃1.5min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min;2%瓊脂糖電泳分離PCR產(chǎn)物。對(duì)52份柿屬雄性種質(zhì)ISSR分析結(jié)果如下:從58條ISSR引物中篩選得到20條隨機(jī)引物,共擴(kuò)增得到274條譜帶,平均多態(tài) 性比率92.33%,30個(gè)種
5、質(zhì)特異性標(biāo)記,平均多態(tài)性信息含量為0.7119。3種方法聚類分析結(jié)果表明中國(guó)柿種質(zhì)、日本柿種質(zhì)可以分成不同的3-5組,甜柿與澀柿雖不能截然分開(kāi),但甜、澀柿種質(zhì)基本可以分為不同的組,僅有2個(gè)完全甜柿種質(zhì)分在澀柿1組中;3個(gè)韓國(guó)澀柿品種和中國(guó)澀柿品種親緣關(guān)系密切,分組 結(jié)果和地理起源較為一致;完全雄性種質(zhì)和羅田甜柿親緣關(guān)系密切,寶蓋甜柿與磨盤柿(羅田)親緣關(guān)系密切,湘西甜柿同日本甜柿親緣關(guān)系密切;柿屬其它種明顯和栽培柿品種區(qū)分開(kāi),老鴉柿和
6、栽培柿品種親緣關(guān)系最遠(yuǎn),野柿和栽培柿品種親緣關(guān)系最近,油柿和栽培柿品種親緣關(guān)系近于君遷子,支持金棗柿作為獨(dú)立種;3種聚類方法結(jié)果有少部分出入,但基本分組結(jié)果一致;主成分分析和主坐標(biāo)分析支持聚類分析結(jié)果。 4. 28份柿屬種質(zhì)RAPD數(shù)據(jù)及ISSR數(shù)據(jù)比較整合結(jié)果表明:RAPD與ISSR相似系數(shù)矩陣的相關(guān)系數(shù)r=0.8624,匹配良好,二者結(jié)合能更好解釋柿屬種質(zhì)親緣關(guān)系;ISSR聚類分組結(jié)果與RAPD分析結(jié)果相同。二者多態(tài)性比率無(wú)
7、差異,多 態(tài)性信息含量也無(wú)差別。RAPD的標(biāo)記指數(shù)高于ISSR標(biāo)記。 5.優(yōu)化得到適合柿屬植物ITS-PCR技術(shù)體系:1×PCR Buffer,Mg<'2+>2.0mmol/L,dNTPs 0.2mmol/L,primer 0.25 μ mmol/L,0.05μL Taq DNA聚合酶,DMSO 5%,50ng模板DNA,其余雙蒸水補(bǔ)充體系,反應(yīng)總體積25 μ L;ITS-PCR擴(kuò)增程序:97℃預(yù)變性5min;97℃變性30s
8、,57℃退火1min,72℃延伸lmin,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。 6.優(yōu)化得到適合柿屬植物AFLP分析技術(shù)體系參數(shù):基因組DNA限制性內(nèi)切酶切先加入Mse I 65℃溫浴2h,然后加入EcoR I 37℃溫浴4h;采用5倍酶切連接產(chǎn)物稀釋液進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增;預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)及選擇性擴(kuò)增體系中Mg<'2+>濃度均為1.5mmol/L;預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)及選擇性擴(kuò)增體系中dNTPs濃度分別為0.1mmol/L和 0.2mmol/L。其余參照
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