單細(xì)胞比較基因組雜交技術(shù)及其在胚胎植入前遺傳學(xué)篩查中的應(yīng)用.pdf

1、目的:染色體非整倍體是胚胎發(fā)育異常、自然流產(chǎn)、先天性出生缺陷的重要因?yàn)?對(duì)植入前胚胎行非整倍體篩查(preimplantationgenetic screening,PGS),不但可以選擇染色體正常的胚胎移植,提高正常妊娠率,降低流產(chǎn)率,預(yù)防出生缺陷,而且為分析胚胎染色體異常因?yàn)榧疤接懭旧w病發(fā)生機(jī)制提供了極好的材料。傳統(tǒng)的應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)進(jìn)行非整倍體篩查

2、的方式存在僅能檢測(cè)少數(shù)幾條染色體、費(fèi)用高且費(fèi)時(shí)等諸多缺點(diǎn),因而建立高通量的單細(xì)胞比較基因組雜交(comparative genomichybridization,CGH)技術(shù)用于PGS,具有重要意義。
　　 研究方法:選用引物延伸預(yù)擴(kuò)增(primer extension preamplification,PEP)結(jié)合簡(jiǎn)并核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotideprimed-PCR,DOP-PCR)方

3、法,對(duì)已知核型的不同單細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification,WGA),在擴(kuò)增時(shí)標(biāo)記紅色熒光素,與標(biāo)有綠色熒光素的正常男性DNA等量混勻,按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行CGH檢測(cè)并分析其結(jié)果,通過與核型比較建立單細(xì)胞CGH的技術(shù)平臺(tái)。應(yīng)用該技術(shù)平臺(tái),對(duì)發(fā)育異常胚胎單卵裂球、植入前囊胚的外滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行非整倍體檢測(cè),探討單細(xì)胞CGH的應(yīng)用可行性,為胚胎發(fā)育、植入學(xué)診斷及胚胎干細(xì)胞建系提供新的遺傳學(xué)分析手段。

4、　　 結(jié)果:選用PEP-DOP-PCR方法可成功擴(kuò)增16個(gè)已知核型的單細(xì)胞基因組DNA,應(yīng)用于CGt{能正確反映染色體拷貝數(shù),相比于單純的DOP-PCR,PEP-DOP-PCR擴(kuò)增更加穩(wěn)定,更適合應(yīng)用于單細(xì)胞CGH。
　　 在對(duì)23個(gè)發(fā)育異常胚胎的不同單卵裂球進(jìn)行檢測(cè)時(shí),單細(xì)胞CGH技術(shù)成功檢出染色體異常,結(jié)合FISH技術(shù)檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)卵裂期異常胚胎存在較大比例的染色體非整倍體與胚胎嵌合現(xiàn)象；應(yīng)用單細(xì)胞COH成功分析了17個(gè)植

5、入前囊胚,發(fā)現(xiàn)胚胎囊胚期的染色體異常率明顯低于卵裂期,檢出一例21三體核型胚胎,以此指導(dǎo)胚胎干細(xì)胞建系后經(jīng)染色體顯帶核型分析驗(yàn)證了CGH結(jié)果。
　　 結(jié)論:采用PEP-DOP-PCR擴(kuò)增方法結(jié)合CGt{能夠建立可信的單細(xì)胞CGH技術(shù)平臺(tái)。通過該技術(shù)的應(yīng)用證實(shí)了染色體非整倍體是導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常的一個(gè)重要因素,同時(shí)發(fā)現(xiàn)了胚胎嵌合情況的存在。單細(xì)胞CGH在囊胚活檢上取得的成功,預(yù)示了其在植入前遺傳學(xué)篩查中的應(yīng)用前景。其結(jié)果與干細(xì)胞核型

6、分析結(jié)果的一致性,也為特定核型人類胚胎干細(xì)胞建系提供了新策略。
　　 植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening,PGS),可篩選出遺傳正常的體外授精胚胎植入子宮,降低妊娠遺傳性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。目前的PGS方式主要基于熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測(cè)植入前胚胎的非整倍體,但FISH-PGS只能檢測(cè)有限的幾條染色體,通過對(duì)胚