第一極體熒光原位雜交技術(shù)在女性染色體易位攜帶者植入前遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用.pdf

1、近二十余年來(lái)，輔助生育技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)蓬勃發(fā)展，植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)在二者有機(jī)結(jié)合的基礎(chǔ)上應(yīng)用而生。1990年，HandysideAH成功地完成了世界上第一例PGD，近年來(lái)PGD自身檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，新的分子生物學(xué)技術(shù)不斷應(yīng)用，除了聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction，PCR)及熒光原位雜交(Fluorescenceinsitu，F(xiàn)ISH

2、)兩種技術(shù)應(yīng)用于PGD，在此基礎(chǔ)上還衍生了一些新的技術(shù)。如核轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的染色體進(jìn)行光譜核型分析(Spectralkaryotyping，SKY)或24色多色FISH技術(shù)(Multi-fluorochromekaryotyping)分析，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增及比較基因組雜交技術(shù)(Comparativegenomichybridization,CGH)，引物原位標(biāo)記技術(shù)(Primedinsitulabeling，PRINS)等，這些技術(shù)的出現(xiàn)為

3、PGD的進(jìn)一步發(fā)展拓展了更為廣闊的空間。PGD應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，除了可以進(jìn)行性連鎖疾病、單基因遺傳性疾病、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常的檢測(cè)，還可用于人類(lèi)腫瘤易感綜合征的易感性分析及一些遲發(fā)性疾病的基因預(yù)測(cè)，以及應(yīng)用PGD技術(shù)進(jìn)行HLA配型。到2004年為止，全世界已進(jìn)行了超過(guò)6000個(gè)臨床PGD周期，誕生了1000多個(gè)健康嬰兒。 染色體易位是一種常見(jiàn)的遺傳缺陷，它是指兩條及兩條以上染色體的斷裂產(chǎn)生的染色體片段位置的改變。平衡易位是最

4、常見(jiàn)的染色體結(jié)構(gòu)異常。據(jù)報(bào)道，群體中相互易位的發(fā)生率約為1/500～1/1000，羅式易位的發(fā)生率約為1/900～1/1000。而在不育及反復(fù)自然流產(chǎn)患者中，易位的發(fā)生率顯著增高達(dá)1％～10％。染色體易位的攜帶者一般都沒(méi)有遺傳物質(zhì)的丟失或者是丟失不多，因而表型正常，但可將不平衡的染色體傳給子代，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、畸形兒或不孕不育等。部分男性攜帶者還可能因染色體斷裂區(qū)域涉及精子發(fā)生相關(guān)基因或調(diào)控基因而伴有生精障礙導(dǎo)致不育。因此染色體結(jié)構(gòu)異常

5、伴隨的生育障礙對(duì)患者的身體及精神方面均帶來(lái)極大的危害。對(duì)于渴望生育健康正常后代的夫婦來(lái)說(shuō)，以前所能借助的方法是在孕早期或孕中期行產(chǎn)前診斷取羊水細(xì)胞或絨毛對(duì)胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，和借助于B超診斷胎兒有無(wú)形態(tài)學(xué)異常，但往往面臨要選擇流產(chǎn)或引產(chǎn)的難題，植入前遺傳學(xué)診斷的出現(xiàn)，為這些患者提供了除產(chǎn)前診斷以外另一種選擇，能早期同時(shí)解決生育及遺傳診斷這兩大難題，實(shí)現(xiàn)他們生育正常后代的愿望。 目前對(duì)染色體異?；颊哌M(jìn)行PGD有兩種途徑，即對(duì)極體或

6、卵裂球進(jìn)行染色體分析，最常用的分析方法是熒光原位雜交。在用FISH技術(shù)診斷染色體易位時(shí)，主要有以下幾種方法：(1)活檢處于分裂間期的卵裂球，采用兩種易位染色體的端粒探針和其中一條染色體斷裂點(diǎn)近端探針聯(lián)合的方法進(jìn)行FISH(對(duì)于羅氏易位攜帶者，采用易位的染色體的位點(diǎn)特異性探針)。用卵裂球進(jìn)行PGD存在的問(wèn)題主要是難以區(qū)分正常和平衡的胚胎，不能真正實(shí)現(xiàn)優(yōu)生的目的，另外卵裂階段的胚胎嵌合體發(fā)生率很高，卵裂階段單個(gè)卵裂球的檢測(cè)并不能代表整個(gè)胚胎

7、的狀態(tài)，可能造成漏診和誤診。(2)采用跨斷裂點(diǎn)探針篩選跨越或是臨近斷裂點(diǎn)的克隆，并標(biāo)記上不同的顏色，通過(guò)不同顏色信號(hào)的分離和重疊，可分辨各類(lèi)染色體結(jié)構(gòu)異常，包括染色體平衡和非平衡易位、倒位、染色體內(nèi)部重組和微缺失等，但由于跨斷裂點(diǎn)探針制作周期較長(zhǎng)，費(fèi)用較高，該技術(shù)亦未能廣泛應(yīng)用于臨床。(3)間期核轉(zhuǎn)換，近年來(lái)有學(xué)者發(fā)展了從間期核獲得中期染色體的技術(shù)，Verlinsky等進(jìn)一步發(fā)展了該技術(shù)并將其應(yīng)用于PGD，用活檢獲得的卵裂球與去核的鼠合

8、子融合，得到分裂期的染色體，用全染色體涂抹探針(wholechromosomepaintingprob,WCP)結(jié)合著絲粒探針(centromereenumerationprobe，CEP)和端粒探針，可應(yīng)用于各種染色體易位的PGD，但這種方法較為復(fù)雜，需要特殊的儀器設(shè)備(如電融合儀等)、顯微操作技術(shù)和中期核固定技術(shù)，耗時(shí)、費(fèi)力，有效性有限，難以臨床普遍開(kāi)展。(4)近年來(lái)，也有學(xué)者嘗試將比較基因組雜交應(yīng)用于染色體易位的分析，該技術(shù)不需染

9、色體培養(yǎng)，一次雜交實(shí)驗(yàn)即可檢測(cè)出待測(cè)樣本整個(gè)基因組情況，彌補(bǔ)了FISH僅能檢測(cè)個(gè)別染色體或部分位點(diǎn)的不足，但CGH實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣，對(duì)操作人員和圖像分析系統(tǒng)要求高，且整個(gè)過(guò)程需要時(shí)間較長(zhǎng)，診斷后的胚胎需要冷凍，該技術(shù)普遍應(yīng)用于臨床尚需一段時(shí)間。(5)對(duì)于女方染色體易位攜帶者，還可以采用第一極體進(jìn)行分析。由于第一極體的染色體在排卵后有限的時(shí)間內(nèi)處于分裂期，可用WCP探針通過(guò)FISH方法檢測(cè)第一極體的染色體結(jié)構(gòu)來(lái)推斷卵子染色體組成。應(yīng)用第一極體

10、進(jìn)行植入前診斷具有安全性高、避免倫理道德的沖突以及胚胎期高比例的嵌合型的影響等優(yōu)點(diǎn)，能夠區(qū)分正常和平衡易位胚胎，還能為研究卵子分離的規(guī)律提供信息。1998年Munné等首次應(yīng)用第一極體對(duì)女性染色體易位攜帶者進(jìn)行PGD，獲得了成功妊娠。但由于極體活檢和固定的難度高，以及極體本身一些生物學(xué)特性的限制，應(yīng)用全染色體涂抹探針對(duì)第一極體進(jìn)行FISH的研究不多，我國(guó)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 本研究將針對(duì)染色體易位攜帶者引起的不育及反復(fù)自然流產(chǎn)等生育