DcR3對肝移植術(shù)后肝臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、DcR3是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的分子，屬于腫瘤壞死因子受體超家族的成員。其ORF編碼300個(gè)氨基酸，其中包括由29個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽，但沒有跨膜區(qū)，是一個(gè)分泌性的蛋白。主要在胃、脊髓、結(jié)腸、淋巴結(jié)、脾臟、內(nèi)皮細(xì)胞以及肺和結(jié)腸來源的腫瘤細(xì)胞表達(dá)。DcR3的配體包括FasL、LIGHT和TL1A，均是TNF家族成員。 最近的研究表明DcR3能抑制FasL和IFN-γ所致的胰島細(xì)胞凋亡、胰島素釋放受損，提高胰島移植成功率

2、及延長其生存時(shí)間。有研究證實(shí)于心臟移植前一天開始連續(xù)7天靜脈注射DcR3蛋白，小鼠心臟存活時(shí)間比對照組延長3.3天。其研究結(jié)果強(qiáng)烈提示DcR3的免疫抑制效應(yīng)可能在控制移植排斥反應(yīng)中有一定的作用。 DcR3主要通過與Fas競爭性結(jié)合FasL而阻斷FasL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞與APC的相互作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的分化與激活，抑制免疫反應(yīng)中T細(xì)胞擴(kuò)增和CXCL12/SDF-1α、FasL對T細(xì)胞的趨化作用，產(chǎn)生免

3、疫抑制效應(yīng)。與肝移植聯(lián)系起來考慮，DcR3可能通過抑制CXCL12/SDF-1α及FasL對T細(xì)胞的趨化作用、阻斷CTL細(xì)胞通過Fas/FasL途徑對肝臟的攻擊而發(fā)揮死亡誘騙受體的作用。但是靜脈注射DcR3蛋白不能將其免疫抑制作用局限于肝臟之中，全身性的副作用較大。因此我們有理由推測：若能通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將DcR3表達(dá)在移植肝中，將可能有助于將其免疫抑制作用局限在肝臟之中，抑制宿主CTL細(xì)胞對移植肝的攻擊。 AAV基因組可定點(diǎn)整合

4、至宿主染色體，既可避免隨機(jī)整合可能出現(xiàn)的插入性突變，又能保證目的基因的長期穩(wěn)定表達(dá)。因此在誘導(dǎo)肝移植耐受時(shí)，AAV可作為免疫調(diào)節(jié)或移植物保護(hù)分子轉(zhuǎn)染的理想載體。由于DcR3蛋白的代謝迅速，半衰期僅有20分鐘左右，因此將AAV作為載體轉(zhuǎn)染移植肝，可望實(shí)現(xiàn)DcR3蛋白在移植肝的長期表達(dá)，從而對移植肝產(chǎn)生保護(hù)作用，同時(shí)避免靜脈注射DcR3蛋白所致的全身性副作用。 基于以上分析，我們設(shè)想用重組DcR3/AAV感染供肝，將DcR3表達(dá)于供

5、肝組織中，利用其免疫抑制效應(yīng)，抑制宿主CTL細(xì)胞對移植肝的攻擊，從而延長移植肝的存活時(shí)間。我們先進(jìn)行DcR3基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)鑒定；然后進(jìn)行重組DcR3/AAV的組裝及鑒定；最后以近交系大鼠肝移植模型為基礎(chǔ)，研究DcR3基因轉(zhuǎn)染對移植術(shù)后肝臟的保護(hù)作用。通過這些研究，闡明DcR3基因在肝臟的表達(dá)在保護(hù)移植肝免受排斥反應(yīng)損傷中的作用，探討防止急性排斥反應(yīng)和延長移植肝存活時(shí)間的新手段。本文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果包括： 1.采

6、用PCR技術(shù)克隆DcR3cDNA編碼序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體。檢測了重組DcR3/pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果DcR3蛋白的表達(dá)正確。DcR3真核表達(dá)載體的構(gòu)建成功為重組DcR3/AAV的包裝奠定了良好的基礎(chǔ)。我們進(jìn)一步用激光共聚焦顯微技術(shù)成功檢測到重組DcR3/pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)，并證明質(zhì)粒中GFP與DcR3在真核細(xì)胞中的表達(dá)具有一致性，提示可以將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞中G

7、FP的表達(dá)作為DcR3表達(dá)的標(biāo)志。 2.通過優(yōu)化AAV-293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件，成功在AAV-293細(xì)胞中包裝出重組DcR3/AAV并進(jìn)行純化及純度、滴度測定，獲得了高純度、高滴度的重組DcR3/AAV。我們還用純化的重組DcR3/AAV感染真核細(xì)胞，檢測其攜帶的DcR3基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果純化的重組DcR3/AAV感染真核細(xì)胞后，其攜帶的DcR3基因可在真核細(xì)胞中正常地表達(dá)。 3.以近交系大鼠肝移植模型為基礎(chǔ)

8、，將重組DcR3/AAV感染移植肝，通過觀察大鼠的生存情況、檢測肝臟功能、觀察DcR3在肝臟的表達(dá)及肝臟病理改變，發(fā)現(xiàn)肝外器官中沒有轉(zhuǎn)染的DcR3基因表達(dá)；DcR3在肝臟組織中的表達(dá)與G4組大鼠生存時(shí)間延長、肝功能變化、肝臟組織中淋巴細(xì)胞浸潤時(shí)間滯后、數(shù)量減少及肝組織的破壞程度減輕相關(guān)。 綜上，本研究證實(shí)轉(zhuǎn)染的DcR3基因僅在移植肝中表達(dá)；DcR3在肝臟組織中的表達(dá)能明顯延長大鼠生存時(shí)間、減輕肝功能損害、抑制移植肝臟組織中淋巴細(xì)