采用轉(zhuǎn)基因小鼠初步探討核仁素的心肌保護(hù)作用.pdf_第1頁(yè)
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1、目的：構(gòu)建在心肌中特異性表達(dá)外源性核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠，研究核仁素在整體動(dòng)物水平能否發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
　　 方法：①利用基因重組技術(shù)構(gòu)建小鼠核仁素基因表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-Ncl)，轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后，采用RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)小鼠核仁素基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)能力；②將具有表達(dá)能力的小鼠核仁素基因序列通過(guò)基因重組方法構(gòu)建心肌特異表達(dá)外源性核仁素蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(Alpha-MyHc clone26-

2、Ncl)，經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證其準(zhǔn)確性；③制備心肌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)外源性核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠，采用PCR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型。采用real-time PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠心肌中核仁素基因的相對(duì)含量；采用Western-blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織及其他組織中核仁素蛋白的表達(dá)。④采用組織切片及髓染色法觀察轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織形態(tài)；測(cè)量心臟重量、體重、心臟重量指數(shù)；測(cè)量左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)，觀察核仁素在心肌

3、組織高表達(dá)后對(duì)小鼠心臟形態(tài)功能是否有影響。⑤應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠制備心肌缺血-再灌注損傷模型，檢測(cè)心肌caspase-3活性、血清肌酸激酶活性和左室壓最大上升速率(+LV Max dP/dt)變化，研究核仁素對(duì)心肌缺血.再灌注損傷的影響。
　　 結(jié)果：①成功構(gòu)建核仁素真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-Ncl)和小鼠核仁素基因的心肌特異性表達(dá)載體(Alpha-MyHc clone26-Ncl)，制備了核仁素在心肌組織內(nèi)特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因

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