熒光原位雜交技術(shù)在食管癌研究中的應(yīng)用及環(huán)氧合酶-2與食管癌的相關(guān)性研究.pdf

1、食管鱗狀細(xì)胞癌是我國北方地區(qū)高發(fā)的食管鱗狀上皮來源的惡性腫瘤。盡管近年來腫瘤的綜合治療措施取得了較大進(jìn)展，但食管癌患者的生存率并未得到明顯改善。目前研究表明，食管癌發(fā)病是一個多因素、多階段、多基因參與的復(fù)雜過程。食管癌的細(xì)胞與分子遺傳學(xué)研究為揭示其發(fā)病機(jī)理提供了有益的線索。 染色體畸變是腫瘤細(xì)胞的顯著特征之一。在眾多研究染色體畸變的細(xì)胞及分子遺傳學(xué)方法中，熒光原位雜交以其靈敏性好、特異性強(qiáng)、信號-噪聲比高，并可以鑒定染色體結(jié)構(gòu)和

2、數(shù)目異常，成為現(xiàn)代腫瘤遺傳學(xué)研究中最為常用的技術(shù)手段之一。 本研究從染色體水平、染色體區(qū)帶水平和基因水平三個層次，探討了熒光原位雜交技術(shù)在食管癌研究中的應(yīng)用。為了研究食管癌細(xì)胞的全染色體畸變，本研究利用重復(fù)多色熒光原位雜交技術(shù)，將24條特異性的染色體(22條常染色體和2條性染色體)涂染探針，分別用Cy3、Cy5、FITC和DEAC四種熒光素按一定組合直接標(biāo)記，制備兩組十二色的探針池，對細(xì)胞系KYSE140的同一染色體片先后兩次雜

3、交，進(jìn)行全染色體畸變分析。為了探討同一染色體臂上不同區(qū)帶的非同步性改變，采用多色熒光原位雜交方法，用Cy3、Cy5和FITC三種熒光素分別標(biāo)記3q、8q、11q上的三個區(qū)帶，檢測這些區(qū)帶在細(xì)胞系EC9706的擴(kuò)增或畸變。最后，在常規(guī)FISH技術(shù)的基礎(chǔ)上，我們設(shè)計(jì)了一種新的制片方法，建立間期核陣列；然后利用基因特異性BAC探針，檢測Nek2和Hec1基因在食管癌組織標(biāo)本中的擴(kuò)增情況。 通過本研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞系KYSE140中，大部

4、分染色體都出現(xiàn)了異常改變。其中1、2、3、7、8號染色體存在明顯的擴(kuò)增，11、13和18號染色體均有一條丟失。檢測到19個衍生染色體，其中多數(shù)是由兩條染色體的部分區(qū)段構(gòu)成；有3個衍生染色體涉及到了3個不同的染色體。通過對細(xì)胞系EC9706三條染色體長臂的分析，發(fā)現(xiàn)3號染色體長臂擴(kuò)增且末端發(fā)生了易位，8號染色體長臂末端出現(xiàn)了擴(kuò)增，11號染色體長臂1區(qū)出現(xiàn)了擴(kuò)增。我們建立的間期核陣列FISH技術(shù)，可以快速有效地檢測基因擴(kuò)增；在61例食管鱗狀

5、細(xì)胞癌組織標(biāo)本中，38例標(biāo)本出現(xiàn)Nek2基因的擴(kuò)增，總擴(kuò)增率為62.3％，17例標(biāo)本出現(xiàn)Hec1基因的擴(kuò)增，總擴(kuò)增率為27.9％，但是沒有發(fā)現(xiàn)Nek2和Hec1基因的擴(kuò)增與臨床病理參數(shù)之間存在相關(guān)關(guān)系。 食管癌發(fā)病及其進(jìn)展涉及了多個基因和蛋白，環(huán)氧合酶-2是近些年來研究較多的一個。它是前列腺素合成過程中的一個重要限速酶；在正常生理情況下，絕大多數(shù)組織細(xì)胞并不表達(dá)環(huán)氧合酶-2；但是它可以在內(nèi)外刺激因素的作用下，出現(xiàn)早期快速誘導(dǎo)性表

6、達(dá)。 為了探討環(huán)氧合酶-2與食管癌的相關(guān)性，本研究用免疫組織化學(xué)的方法，檢測了環(huán)氧合酶-2在食管癌組織標(biāo)本的表達(dá)情況；用真核表達(dá)型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH3T3，觀察環(huán)氧合酶-2對正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力；用正義和反義核酸分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞系EC9706，觀察環(huán)氧合酶-2對細(xì)胞生長、細(xì)胞周期和致瘤性的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，在檢測的69例食管鱗癌臨床標(biāo)本中，31例出現(xiàn)了環(huán)氧合酶-2的高表達(dá)，與正常食管上皮組織有顯著性差異；環(huán)

7、氧合酶-2在高分化鱗癌中的表達(dá)率為69.6％，高于其在低分化和中分化鱗癌中的表達(dá)(表達(dá)率分別為38.2％和16.7％)；環(huán)氧合酶-2在食管癌的表達(dá)與臨床病理分期存在正相關(guān)(P=0.045)。轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞系的研究表明，環(huán)氧合酶-2導(dǎo)入后，在軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)并沒有出現(xiàn)細(xì)胞克隆。用正義和反義核酸分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞系EC9706后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長曲線并未發(fā)生改變，反義轉(zhuǎn)染細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例降低，在軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)中，生長的細(xì)胞克隆數(shù)目較

8、空轉(zhuǎn)和正義核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞為少。 綜上所述，可以得到如下結(jié)論：(1)重復(fù)多色熒光原位雜交技術(shù)能夠用于全染色體畸變分析；應(yīng)用區(qū)帶特異性探針可以發(fā)現(xiàn)同一染色體臂內(nèi)不同區(qū)帶的非同步變化；應(yīng)用間期核陣列熒光原位雜交技術(shù)檢測基因擴(kuò)增具有簡單、易行、節(jié)約、快速的優(yōu)點(diǎn)；Nek2基因在食管鱗癌存在高頻擴(kuò)增，對Nek2基因的異常表達(dá)可能起有一定作用；(2)環(huán)氧合酶-2在食管癌變和進(jìn)展中起有一定作用，但其單獨(dú)并不能轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞；環(huán)氧合酶-2可以將細(xì)胞周