去泛素化酶10在過敏性哮喘中的免疫調節(jié)機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討去泛素化酶10(Ubiquitin-specific peptidase10,USP10)在過敏性支氣管哮喘中的表達特征,及其在過敏性支氣管哮喘中對Th1細胞特異性轉錄因子T-bet穩(wěn)定性的影響,從而對哮喘免疫狀態(tài)的調節(jié)作用。為支氣管哮喘的免疫學發(fā)病基礎提供新觀點,并為尋求免疫學治療新方法提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　(一)過敏性哮喘中T-bet相關去泛素化酶研究:HEK293T細胞系中共表

2、達T-bet及多種T細胞中高表達的去泛素化酶,以免疫共沉淀篩選出與T-bet蛋白存在相互關系的去泛素化酶(以下表達為USPx),并在過敏性哮喘患者及健康對照者外周血PBMC及CD4+T細胞中通過熒光定量PCR方法檢測T-bet、GATA-3、Foxp3、IFN-γ和USPx mRNA表達水平。
　　(二)體外細胞實驗:HEK293T細胞共轉染過表達T-bet與USPx質粒,經免疫共沉淀實驗及免疫印跡法明確USPx對T-bet蛋白調

3、節(jié)作用的具體方式,并以免疫熒光共聚焦觀察兩種蛋白作用定位。槲皮素處理增強泛素化影響USPx作用,明確USPx對T-bet的調節(jié)方式。
　　(三)動物模型研究:SPF級BALB/c小鼠隨機分為陰性對照組、哮喘組及槲皮素處理組,每組8只,哮喘組以OVA致敏及激發(fā),對照組則以PBS代替OVA,槲皮素處理組則在哮喘組的基礎上,激發(fā)后腹腔注射槲皮素。血清總IgE及肺組織切片H&E染色評估各組病情,流式細胞術比較外周血、肺組織CD4+T細胞T

4、-bet、GATA-3、Foxp3、IFN-γ、USPx蛋白表達,RT-PCR檢測以上組織內細胞T-bet、GATA-3、Foxp3、IFN-γ、USPx基因mRNA表達水平。
　　結果：
　　1.以免疫共沉淀篩選出USP10與T-bet蛋白間存在相互關系,TCR刺激使USP10表達升高。哮喘患者PBMC中T-bet、GATA-3、Foxp3、IFN-γ和USP10mRNA水平較健康對照組顯著提高,組間具有統(tǒng)計學差異;哮喘患

5、者CD4+T細胞中IFN-γ升高,T-bet mRNA變化無統(tǒng)計學意義。
　　2.細胞實驗證實USP10能夠通過去泛素化穩(wěn)定T-bet的表達,兩者相互作用定位于細胞核。
　　3.槲皮素能夠增加哮喘中T-bet的泛素化并在HEK293T細胞系中降低USP10蛋白水平,人原代CD4+T細胞中槲皮素也能使T-bet、IFN-γ、USP10mRNA水平下降,使用蛋白酶體抑制劑組織泛素化后槲皮素對T-bet、IFN-γ、USP10表達

6、的抑制作用減弱。
　　4.動物模型中,與陰性對照組比較,哮喘小鼠模型外周血及肺組織CD4+T細胞增加,T-bet、IFN-γ、GATA3、Foxp3及USP10蛋白水平明顯升高,具有統(tǒng)計學差異。槲皮素處理后外周血及肺組織中CD4+T細胞比例下降,T-bet、IFN-γ及USP10蛋白水平明顯下降。
　　結論：
　　1.病情穩(wěn)定的慢性持續(xù)期哮喘患者免疫細胞中T-bet、IFN-γ和USP10表達水平與健康對照相比明顯升高

7、。USP10能與T-bet產生相互作用,并能隨著TCR刺激表達增加。提示USP10在哮喘的炎癥過程中參與Th1細胞的調節(jié)。哮喘患者CD4+T細胞中IFN-γmRNA升高但T-bet mRNA保持不變,提示USP10通過對T-bet蛋白翻譯后修飾來調節(jié)其功能。
　　2.細胞實驗證實USP10與T-bet在細胞核中產生相互作用,并通過去泛素化穩(wěn)定T-bet的表達、增強其轉錄活性。槲皮素干預降低T-bet的同時降低USP10,此時T-b

8、et水平的下降可能為USP10下降后去泛素化功能下調導致T-bet降解加劇,以及槲皮素降低T-bet的上游因子IFN-γ分泌的共同作用。
　　3.哮喘小鼠模型中T-bet與USP10水平上升,槲皮素增強泛素化后哮喘小鼠炎癥組織CD4+T細胞在哮喘中T-bet、IFN-γ和USP10下降。再次證明USP10能通過去泛素化修飾T-bet蛋白,增加其表達和穩(wěn)定性有助于維持Th1型炎癥細胞的數(shù)量及功能。
　　4.穩(wěn)定的慢性持續(xù)期哮喘