松材線蟲Bx-vaP-1基因在昆蟲細胞中的表達及功能分析.pdf

1、松材線蟲病(Pine wilt disease)又稱松樹萎蔫病或松樹枯萎病，是松樹的一種毀滅性病害。目前已知分布于中國、日本、韓國、美國、加拿大、墨西哥、葡萄牙、西班牙等國家。我國自上世紀80年代初首次發(fā)現(xiàn)該病以來，病情擴散蔓延迅速，已對我國的松林生態(tài)系統(tǒng)構成了嚴重的破壞和威脅，成為我國最危險的森林有害生物之一。該病害的發(fā)生涉及寄主樹種、傳播媒介、松材線蟲及其攜帶的微生物、以及環(huán)境因素等多個方面，至今其致病機理尚存爭議。若要進一步深入揭

2、示松材線蟲病的致病機理，最直接、最有效的方法就是獲取松材線蟲致病過程中的關鍵基因信息，并對其進行功能分析。
　　目前國際上已公認植物寄生線蟲食道腺細胞分泌物在植物線蟲與寄主互作過程早期起到關鍵作用，因此編碼這類分泌物的基因被認為是線蟲的致病相關基因。其中，在食道腺細胞特異表達的類毒液過敏原蛋白基因（Bx-vap-1）已成功在松材線蟲中克隆分離，推測該基因在松材線蟲寄生寄主的早期階段發(fā)揮了重要作用，很可能是松材線蟲的致病基因。

3、>　　本研究即以Bx-vap-1基因為研究對象，采用正向驗證基因功能的方法，將Bx-vap-1基因在昆蟲細胞中表達獲得重組VAP蛋白，用來模擬松材線蟲口腔分泌物，接種三年生馬尾松，檢測不同時期寄主松樹防御基因的表達、萜烯含量的變化以及組織病理學變化，意從分子防御水平、生理代謝水平和組織病理學水平上的寄主響應事件來分析Bx-vap-1基因的功能，從而為松材線蟲病致病機理研究提供理論基礎。主要結(jié)論如下:
　　1.利用Bac-to-Ba

4、c表達系統(tǒng)原理，將松材線蟲Bx-vap-1基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA，將重組質(zhì)粒pFastBac-vap轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，細胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座，獲得重組桿狀病毒表達載體Bacmid-vap。在脂質(zhì)體的介導下，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，病毒擴增3代后收獲重組VAP蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot檢測驗證了目的蛋白的特異性。通過對P2代桿狀病毒轉(zhuǎn)染細胞的M.O.I值和轉(zhuǎn)染時間進行優(yōu)化，最終實

5、現(xiàn)了目的蛋白的大量表達。
　　2.利用RACE技術分離克隆了馬尾松α-蒎烯合成酶基因全長，并結(jié)合生物信息學軟件分析了該基因編碼蛋白的特性。馬尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全長序列共1890bp，編碼629個氨基酸。編碼蛋白的預測分子量為71.94 kDa。α-蒎烯合成酶基因編碼蛋白含有1個金屬結(jié)合結(jié)構域、一個天冬氨酸富集基序(DDMYD)，符合單萜烯合成酶基因的典型特征。序列提交至GeneBank，獲得登錄號KF547035。該基

6、因的分離克隆為研究馬尾松分子防御機制提供了基因信息。
　　3.將重組VAP蛋白作為接種體，模擬松材線蟲口腔分泌物，接種三年生馬尾松，接種試驗表明重組VAP蛋白可以誘導馬尾松α-蒎烯合成酶基因上調(diào)表達和α-蒎烯含量增加，這表明在松材線蟲與松樹互作過程中，線蟲口腔分泌的VAP蛋白可作為激發(fā)子啟動寄主的防御反應，因此編碼VAP蛋白的Bx-vap-1基因是松材線蟲的致病基因。
　　4.重組VAP蛋白接種三年生馬尾松，接種點附近表現(xiàn)出