APE1激活突變型p53及其在肝癌放療抵抗中的協(xié)同作用.pdf

1、肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,每年有600,000新發(fā)病例,并且超過50％的新發(fā)病例和死亡發(fā)生在中國。近年來,雖然肝癌的外科治療取得了一定的突破,但是能夠進行手術(shù)切除的早期病例僅僅15%,其他的非手術(shù)治療療效也始終不能令人滿意。隨著三維適形和調(diào)強放療技術(shù)的臨床應(yīng)用,有效的保護了正常肝臟和臨近的器官,為肝癌的放射治療開創(chuàng)了新的局面。但是放射治療也存在一定的局限性,特別是對一些中晚期、復(fù)發(fā)性腫瘤的放療的療效很差,其主要原因是腫瘤細胞對放

2、射線的抵抗作用。細胞受到放射線照射后,DNA分子主要產(chǎn)生堿基損傷和DNA鏈斷裂,并主要通過體內(nèi)的堿基切除修復(fù)(baseexcisionrepair,BER)和DNA雙鏈斷裂修復(fù)途經(jīng)(DNAdouble-strand-breakrepair,DDSBR)修復(fù)受損的DNA,以維持基因組的穩(wěn)定性。然而對于腫瘤細胞而言,DNA損傷與修復(fù)則是腫瘤細胞對放射線抵抗或不敏感重要機制之一。
　　脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinic/apyr

3、imidinicendonuclease,APE1)是BER途徑的關(guān)鍵限速酶,是細胞放射性損傷和烷化劑致傷重要的修復(fù)因子。此外,APE1還具有氧化還原功能(reduction-oxidation,redox),通過維持細胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的激活還原態(tài),而參與多種關(guān)鍵的細胞反應(yīng),如氧化應(yīng)激,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié),細胞周期控制與凋亡。APE1可通過氧化還原機制調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性,進而調(diào)節(jié)下游靶基因表達,參與腫瘤放化療抵抗。研究報道受AP

4、E1調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子有p53,NF-κB,HIF-α,Fos/Jun(AP-1),PAX-8,ATF/CREB家族等。而肝癌中p53的突變率高達60~70%。我們前期的研究顯示肝癌組織中APE1和mtp53蛋白兩者共表達密切相關(guān),動物實驗結(jié)果顯示APE1siRNA質(zhì)粒+Ad5-wtp53+放療聯(lián)合組生長抑制率顯著高于Ad5-wtp53(Genecine)+放療組,提示APE1和mtp53之間可能存在著調(diào)節(jié)作用,兩者相互協(xié)同進而共同決定肝癌

5、的放療抵抗。過去的研究表明,APE1可以通過氧化還原依賴和非依賴機制激活野生型p53,而這種調(diào)節(jié)作用依賴于p53C端調(diào)節(jié)域(CRD)。由于肝癌中p53基因的突變主要是結(jié)構(gòu)性突變,對p53C端調(diào)節(jié)域沒有影響,因此APE1很可能對mtp53具有同樣激活作用。本研究以人體肝癌為研究對象,旨在探討APE1對mtp53的調(diào)節(jié)作用及其可能機制,為進一步闡明肝癌放療抵抗的分子機制,以及今后對不同基因狀態(tài)的肝癌患者施行個體化的基因治療提供了理論和實驗基

6、礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　1.體外觀察證實mtp53具有”功能獲得”的癌基因作用,并與肝癌的放療敏感性密切相關(guān);
　　2.體外探討敲低APE1增強p53突變的肝癌細胞株放射治療敏感性;
　　3.同時以肝癌中249密碼子突變蛋白R249S為切入點,進一步證實APE1對mtp53具有激活作用以及相關(guān)分子的機制;
　　4.體內(nèi)探討敲低APE1對放射治療p53突變的肝癌細胞裸鼠移植瘤的協(xié)同作用。
　　研究內(nèi)容

7、和方法：
　　1.mtp53癌基因特性及其與肝癌放療敏感性的關(guān)系:選擇p53不同狀態(tài)的肝癌細胞株,以及轉(zhuǎn)染pCMV-mtp53R249S于p53缺陷的細胞Hep3B中,檢測放療敏感性,以確定mtp53癌基因功能及其在放療抵抗中的作用。
　　2.APE1對mtp53R249S的調(diào)節(jié)作用:應(yīng)用p53(-/-)肝癌細胞Hep3B、p53野生肝癌細胞HepG2以及p53突變(R249S)肝癌細胞MHCC97L,分別轉(zhuǎn)染APE1siR

8、NA腺病毒(Ad5/F35-APE1siRNA)抑制APE1的表達,觀察其對肝癌細胞放療敏感性的影響;同時,WesternBlot和qRT-PCR檢測APE1和mtp53表達,以及P53下游基因P21蛋白和mRNA表達的變化。
　　3.APE1對mtp53R249S作用的機制研究:以p53下游靶基因P21啟動子中的P53結(jié)合序列為對象,分別合成線性(P53RE--Line)和干環(huán)結(jié)構(gòu)(p53RE-structure)DNA,應(yīng)用E

9、MSA方法,檢測APE1對非還原型(未經(jīng)DTT處理)和還原型(DTT處理)的mtp53R249S蛋白與P53RE-Iine和p53RE-structure的結(jié)合能力,進而顯示APE1對mtp53R249S與DNA結(jié)合的選擇屬性(線性的,或結(jié)構(gòu)性的)、依賴途徑(redox依賴,或redox非依賴);應(yīng)用p53抗體和APE1抗體進行染色質(zhì)共沉淀(ChIP),Q-PCR方法檢測p21基因DNA,探討APE1對mtp53R249S的激活作用。<

10、br>　　4.APE1對p53突變肝癌細胞移植瘤放射治療敏感性的影響:建立p53突變的肝癌細胞裸鼠移植瘤模型,觀察Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合放射治療對移植瘤生長抑制的協(xié)同作用,測量移植瘤的大小,繪制腫瘤生長曲線,并應(yīng)用Ki-67免疫組化染色和TUNEL法分別檢測腫瘤細胞增殖和凋亡。
　　研究結(jié)果：
　　1.mtp53癌基因特性及其與肝癌放療敏感性的關(guān)系。
　　不同p53狀態(tài)的肝癌細胞株HepG2(wtp53

11、)、Hep3B(p53-/-)和MHCC97L(mtp53,R249S)經(jīng)不同劑量X射線照射后,用MTT檢測肝癌細胞存活情況,克隆形成實驗檢測肝癌細胞克隆形成,以及流式細胞儀檢測肝癌細胞凋亡。隨著照射劑量的增加,肝癌細胞存活率和克隆形成率逐漸降低,同時肝癌細胞凋亡率逐漸增加;但在相同劑量射線照射后,MHCC97L的細胞存活率和克隆形成率都高于HepG2和Hep3B細胞,且MHCC97L的細胞凋亡率低于HepG2和Hep3B細胞,表明在相

12、同放射劑量的照射下,MHCC97L細胞株對放射線最為抗拒;并且,在相同劑量下,Hep3B的細胞存活率和克隆形成率高于HepG2,且其凋亡率比HepG2細胞低,表明p53缺失的肝癌細胞株Hep3B比野生型p53的肝癌細胞HepG2對放射線更加抵抗。因此,不同p53狀態(tài)肝癌細胞株對放射治療敏感性為:HepG2>Hep3B>MHCC97L。
　　在p53缺失的Hep3B肝癌細胞株中分別轉(zhuǎn)染pCMV-wtp53和pCMV-mtp53質(zhì)粒,

13、經(jīng)不同劑量X射線照射后,觀察其對放射治療敏感性。隨著X射線照射劑量的增加,肝癌細胞存活率和克隆形成率逐漸降低,而細胞凋亡率逐漸增加;在相同劑量照射后,細胞存活率和克隆形成率為,pCMV-mtp53組>未轉(zhuǎn)染組>pCMV-wtp53;同時細胞凋亡率為pCMV-wtp53組>未轉(zhuǎn)染組>pCMV-mtp53;表明在相同放射劑量的照射下,轉(zhuǎn)染了pCMV-mtp53的Hep3B細胞株對放射線最抗拒,然而轉(zhuǎn)染了pCMV-wtp53的Hep3B細胞株

14、對放射線最敏感,提示mtp53與肝癌細胞的放療抵抗相關(guān)。
　　2.APE1對mtp53R249S的調(diào)節(jié)作用。
　　Ad5/F35-APE1siRNA感染肝癌細胞株HepG2、Hep3B和MHCC97L,以Ad5/F35-EGFP感染為對照;分別用不同劑量X射線照射后,檢測其對放射治療的敏感性。我們發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增加,Ad5/F35-APE1siRNA組和Ad5/F35-EGFP組肝癌細胞存活率、克隆形成逐漸減低,同時凋亡

15、率逐漸增加;在相同劑量照射下,與Ad5/F35-EGFP組相比,Ad5/F35-APE1siRNA組肝癌細胞存活率和克隆形成率均明顯降低,而凋亡率明顯升高。
　　隨著X射線照射劑量的增加,MHCC97L細胞APE1蛋白表達水平也增加;在6GyX射線照射后APE1蛋白水平達到最大值。我們進一步用Ad5/F35-APE1siRNA腺病毒分別感染HepG2和MHCC97L細胞,經(jīng)6GyX射線照射后,用WesternBlot檢測APE1、

16、P53和P21蛋白表達情況。X射線能夠誘導(dǎo)肝癌細胞APE1蛋白表達增加,Ad5/F35-APE1siRNA有效敲低APE1蛋白表達并且抑制射線誘導(dǎo)的APE1表達;在HepG2細胞中,敲低APE1也能夠抑制射線誘導(dǎo)的WTP53和P21蛋白表達增加;而在MHCC97L細胞中,雖然敲低APE1也抑制了射線誘導(dǎo)的MTP53蛋白表達,但在MHCC97L細胞各處理組中均未檢測到P21蛋白表達。
　　3.APE1對mtp53R249S作用的機制

17、研究。
　　P53的作用是通過與DNA的結(jié)合來實現(xiàn)的,我們選用p53下游基因p21中p53結(jié)合序列,分別合成了線性DNA序列和干環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列,應(yīng)用EMSA檢測非還原型(未經(jīng)DTT處理)和還原型(DTT處理)wtp53蛋白和mtp53蛋白對線性和干環(huán)狀DNA的結(jié)合能力。研究顯示還原型wtp53具有與線性和干環(huán)狀DNA結(jié)合的能力;而還原型mtp53蛋白R249S僅具有對干環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA的結(jié)合能力。分別在HepG2和MHCC97L細胞株

18、轉(zhuǎn)染W(wǎng)TAPE1或Ad5/F35-APE1siRNA,應(yīng)用EMSA檢測顯示APE1能夠促進還原型wtp53與線性和干環(huán)狀DNA的結(jié)合,并且能夠增強還原型mtp53R249S與干環(huán)狀DNA的結(jié)合能力。
　　以p53作用的下游基因p21為檢測p53激活對象,從染色質(zhì)結(jié)合水平研究APE1對p53結(jié)合DNA的活性作用。WTAPE1增強wtp53肝癌細胞株p21DNA結(jié)合水平和p21mRNA和蛋白水平;而敲低APE1抑制p21DNA結(jié)合水平

19、和p21mRNA和蛋白水平。WTAPE1增強mtp53肝癌細胞株p21DNA結(jié)合水平,但是并不能誘導(dǎo)p21mRNA和蛋白表達;同樣,敲低APE1降低了mtp53肝癌細胞株p21DNA結(jié)合水平,也并未改變p21mRNA表達。研究結(jié)果提示在mtp53肝癌細胞株中,APE1可能通過激活了p53下游的其他基因,從而協(xié)同mtp53蛋白的癌基因作用。
　　4.敲低APE1提高肝癌放療敏感性動物實驗研究。
　　在HepG2和MHCC97L

20、裸鼠移植瘤中,Ad5/F35-APE1siRNA+IR聯(lián)合組的抑瘤率和腫瘤細胞凋亡率顯著高于其他治療組;Ad5/F35-APE1siRNA治療組與IR治療組比較抑瘤率和細胞凋亡率均無顯著差異,但均強于對照組。Ki-67免疫組化顯示,Ad5/F35-APE1siRNA+IR組細胞增殖率明顯低于對照組和其他治療組;Ad5/F35-APE1siRNA治療組和IR治療組細胞增殖率均明顯低于與對照組,而Ad5/F35-APE1siRNA治療組與I

21、R治療組細胞增殖率沒有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.不同p53狀態(tài)的肝癌細胞株對放射治療敏感性不同,HepG2最強,Hep3B次之,MHCC97L最弱;且pCMV-mtp53轉(zhuǎn)染p53缺失的肝癌細胞株后,其對放療最為抵抗,提示mtp53與肝癌細胞的放療抵抗相關(guān)。
　　2.Ad5/F35-APE1siRNA能夠增強p53突變肝癌細胞株的對放射治療敏感性;APE1可能通過與Mtp53蛋白相互作用,激活了Mtp53下游的其