G-CSF動員自體骨髓源性細胞對博萊霉素所致小鼠肺損傷的治療作用探討.pdf

1、骨髓源性細胞(BMDCs)包含有多種類型的骨髓干細胞。粒細胞集落刺激因子(G-CSF)可以動員BMDCs進入血液循環(huán)，并且BMDCs可以向其它類型的組織細胞分化。本實驗擬用G-CSF動員BMDCs入血，并觀察其對博萊霉素誘導的肺損傷的修復作用和機制。 第一部分實驗小鼠的骨髓重建 目的： 用綠色熒光蛋白(GFP)標記BMDCs，為后續(xù)實驗中BMDCs在體內的示蹤研究做準備。 方法： 20只C57BL

2、/6J小鼠隨機分為2組，每組10只，A組為移植組(全身照射+骨髓移植)；B組為對照組(全身照射)。兩組分別給予致死劑量照射后，A組接受GFP轉基因小鼠的骨髓移植，B組不予移植。觀察指標：(1).存活和體重變化情況；(2).外周血白細胞數(shù)量；(3).實驗第28天時骨髓細胞中GFP表達情況。 結果： (1).對照組小鼠在照射后體重明顯下降，并在照射后11天內陸續(xù)死亡；移植組小鼠體重在照射后一周內出現(xiàn)輕微下降而后逐漸恢復正常，

3、僅有2只小鼠在11天內死亡； (2).對照組小鼠外周血白細胞在第5天時降為零，移植組小鼠外周血白細胞數(shù)量在照射后第5天明顯下降，但在28天時恢復至正常水平。 (3).實驗第28天時移植組存活小鼠的骨髓細胞經(jīng)流式細胞檢測GFP陽性比例與GFP轉基因小鼠相當。 結論：骨髓移植后小鼠存活率可達80％，重建后的骨髓細胞帶有GFP標記，可用于后續(xù)實驗。 第二部分骨髓重建后小鼠自體BMDCs動員對博萊霉素所致肺損傷的

4、影響 目的： 觀察G-CSF動員自體BMDCs入血，以及對博萊霉素誘導的小鼠肺損傷的修復作用。 方法： 60只骨髓重建后的小鼠隨機分為兩組，每組各30只，A組為動員組(博萊霉素+G-CSF)；B組為對照組(博萊霉素+生理鹽水)。每組再各分為3個亞組，分別在實驗第3、7和14天處死取材。觀察項目包括： (1).肺組織病變肉眼下大體觀察： (2).肺組織病理切片在光學顯微鏡下觀察： (

5、3).Masson三聯(lián)染色觀察肺組織內膠原沉積； (4).免疫組化方法檢測肺組織內細胞因子表達，包括：轉化生長因子-β1(TGF-β1)、干擾素-γ(IFN-γ)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)； (5)肺組織內羥脯氨酸含量的測定； (6).肺組織內GFP陽性細胞的表達情況。 結果： (1).兩組小鼠的肺組織在肉眼觀察下無明顯差異； (2).肺組

6、織病理切片在光學顯微鏡下觀察，A組小鼠在第7天時炎癥程度明顯輕于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在第3和第14天時差異不明顯； (3).肺組織Masson染色結果顯示，A組小鼠在第3和第7天時肺內膠原沉積明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。在第14天時差異不明顯； (4).A組小鼠肺組織內TGF-β1的表達在第3和第7天時明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)； (5).A組小鼠肺組織

7、內IFN-γ的表達在第3天時明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)； (6).A組小鼠肺組織內MMP-9的表達在第7和第14天時明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)： (7).兩組小鼠肺組織內TIMP-1的表達在各時間點均無明顯差異； (8).A組小鼠肺組織內羥脯氨酸的含量在第7天時明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)； (9).流式細胞儀檢測顯示，A組小鼠肺組織內GFP陽性細胞的比例

8、在第7天時最高，而且與B組小鼠相比差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)； (10).A組小鼠在第3天和第7天時，肺組織冰凍切片內均可觀察到綠色熒光細胞存在。B組在實驗觀察的各時間點均未觀察到有明顯的綠色熒光細胞存在。 結論： G-CSF動員BMDCs對博萊霉素所致的肺損傷有一定的保護作用，可能與肺內有一定數(shù)量的BMDCs聚集和下調肺內致纖維化因子相關。 第三部分非骨髓重建小鼠自體BMDCs動員對博萊霉素所致肺

9、損傷的影響 目的： 觀察粒細胞集落刺激因子(G-CSF)動員自體BMDCs對博萊霉素所致的小鼠肺損傷的修復作用及機制探討。 方法： 75只C57BL/6J小鼠隨機分為三組，C組為動員組，n=30，(博萊霉素+G-CSF)；D組為對照組，n=30，(博萊霉素+生理鹽水)；N組為正常組，n=15，(生理鹽水代替博萊霉素)。每組再各分為3個亞組，分別在實驗第3、7和14天處死取材。觀察項目包括： (1)

10、.肺組織病變肉眼下大體觀察； (2).肺組織病理切片在光學顯微鏡下觀察； (3).Masson三聯(lián)染色觀察肺組織內膠原沉積： (4).免疫組化方法檢測肺組織內細胞因子表達； (5).肺組織內羥脯氨酸含量的測定； (6).肺通透指數(shù)(LPI)：支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量/血清蛋白含量。另將20只C57BL/6J小鼠隨機分為兩組，動員組(E組)10只，(博萊霉素+G-CSF)；對照組(F組)

11、10只，(博萊霉素+生理鹽水)。兩組不設終點，觀察小鼠的存活時間。 結果： (1).C組和D組小鼠的肺組織在肉眼觀察下無明顯差異； (2).肺組織病理切片在光學顯微鏡下觀察，C組小鼠在第7天時炎癥程度明顯輕于D組(p<0.05)； (3).肺組織Masson染色結果顯示，C組小鼠在第7天時肺內膠原沉積明顯低于D組（p<0.05)； (4).C組小鼠肺組織內TGF-β1的表達在第3、7和14天時明顯

12、低于D組（p<0.05)； (5).C組小鼠肺組織內IFN-γ的表達在第3和第7天時明顯低于D組(p<0.05)； (6).C組小鼠肺組織內MMP-9的表達在第7天時明顯低于D組(p<0.05)； (7).C組和D組小鼠肺組織內TIMP-1的表達在各時間點均無明顯差異； (8).C組小鼠肺組織內羥脯氨酸的含量在第7天時明顯低于D組(p<0.05)； (9).C組小鼠肺通透指數(shù)在第3和第7天時與D組