高壓氧暴露對干細(xì)胞動員及急性移植物抗宿主病的影響.pdf

1、研究目的： 對高壓氧(HBO)單獨暴露及聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動員后的小鼠外周血造血干細(xì)胞數(shù)量和T細(xì)胞亞群等的變化進(jìn)行測定。建立穩(wěn)定可靠的急性GVHD小鼠模型,分別對供受體采取HBO處理,并對異基因骨髓移植后急性GVHD的變化與對照組進(jìn)行比較分析,研究HBO對供體移植物的影響,以及對急性GVHD的影響及可能機(jī)制,探討在實施造血干細(xì)胞移植中聯(lián)合HBO對供體進(jìn)行動員及防治急性GVHD可能性,為動員干細(xì)胞和防治急性GVH

2、D提供新思路。 研究方法： 1、采用HBO(0.28MPa,氧濃度為96％～98％,每日一次,每次90min,共2天)單用、細(xì)胞因子G-CSF單用、HBO+G-CSF三種不同方案對BALB/C小鼠造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行動員,測定外周血白細(xì)胞計數(shù)、外周血Sca-1+/CD34細(xì)胞數(shù)量。選用C57BL/6小鼠,比較HBO暴露組和未暴露組的骨髓細(xì)胞得率、脾細(xì)胞得率、CD4+/CD8+比率變化。 2、①制備雄性C57BL/6

3、和雄性BALB/C供體小鼠骨髓細(xì)胞和脾臟細(xì)胞混懸液。②雄性BALB/C受體小鼠一次性接受60Co-γ射線致死劑量全身照射,總劑量為5.0 Gy,劑量率120cGy/min。③移植分組:A組(n=10)：單純照射組；B組(n=10):GVHD陰性對照組,供受體均為BALB/C小鼠；C組(n=29):GVHD陽性對照組；D組(n=12)：單純供體小鼠移植前HBO處理組；E組(n=22)：單純受體小鼠移植后HBO處理組；F組(n=29):HB

4、O組,供受體小鼠移植前-6d～+14d均接受HBO。小鼠HBO暴露條件為0.25MPa,氧濃度為96％～98％,每日一次,每次90min。除A組外,其余5組均輸注5×106個骨髓細(xì)胞和2×107個脾臟細(xì)胞的混懸液。④移植后觀察和檢測：觀察HBO對急性GVHD的影響,從動物生存率、體重變化曲線、臨床表現(xiàn)、病理組織形態(tài)學(xué)改變等方面進(jìn)行了觀察。并選擇移植后+3d、+8d、+15d球后靜脈采血檢測外周血血常規(guī)；移植后+15d天流式細(xì)胞儀檢測CD

5、4+/CD8+比率,+16d處死小鼠,采集小鼠外周血血清,ELISA法測定血清TNF-α,IFN-γ,IL-4,IL-10的水平。實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。 研究結(jié)果： 1、①HBO單獨暴露兩次后BALB/C小鼠外周血白細(xì)胞無明顯變化(P>0.05),細(xì)胞因子G-CSF單用和HBO+G-CSF聯(lián)用兩組分別是暴露前的2.5±0.23、2.8±0.32倍(P<0.05)。②HBO單用

6、組外周血Sca-1+/CD34+細(xì)胞數(shù)量是暴露前的1.76±0.08倍(P<0.05);G-CSF單用和HBO+G-CSF聯(lián)用兩組Sca-1+/CD34+細(xì)胞數(shù)量分別是暴露前的3.3±0.18倍、3.5±0.23倍,組間無差異(P>0.05)。③HBO組骨髓細(xì)胞懸液顏色鮮紅,顯示氧含量升高,骨髓細(xì)胞得率同常壓空氣對照組比較無差異(P>0.05)。④小鼠經(jīng)HBO作用后脾臟明顯縮小,脾臟細(xì)胞得率HBO組較高壓空氣對照組減少2.5±0.28倍

7、(P<0.05)。⑤T細(xì)胞亞群CD4+/CD8+各組無變化(P>0.05)。 2、①經(jīng)致死劑量照射后,不輸任何細(xì)胞的單純照射組小鼠在10d內(nèi)全部死亡,死前外周血象極度低下,死于骨髓衰竭。其余5組小鼠在+3d時外周血三系均降至最低點(P>0.05),+8d造血均開始逐漸恢復(fù)WBC 1.0×109/L,HGB 120g/L,PLT 110×109/L(P>0.05),+15d血象恢復(fù)至WBC 2.0×109/L,HGB 125g/L,PLT

8、 350×109/L(P>0.05)②B、C、D、E、F組骨髓移植后平均生存時間(MST)分別為14.0±0.5d、11.5±0.9d、13.92±1.2d、13.5±1.4d,15.0±0.5d,各組與C組存在統(tǒng)計差異(P<0.05)。觀察期內(nèi)生存率B組(7/10)、C組(13/29)、D組(9/12)、E組(13/22)、F組(25/29),各組相互比較差異顯著(P<0.05)。③除B組外,C、D、E、F各組小鼠在移植后+8d開始相

9、繼出現(xiàn)了急性GVHD表現(xiàn),臨床評分分別為4.0±0.9,1.5±0.5,2.0±0.5,1.0±0.4;+15d臨床評分分別為8.0±0.9,4.0±0.5,5.0±0.7,3.0±0.5;D、E、F組與C組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),D、E與F組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。組織病理檢查結(jié)果表明,BMT后+16天半定量積分分別為31.0±1.6,15.0±0.5,20.0±1.2,11.0±0.7,GVHD組與HBO各組之間存在

10、統(tǒng)計差異(P<0.05)。④移植后+15d測CD4+/CD8+比率各組間無差異(P>0.05)。⑤在+16d小鼠血清細(xì)胞因子水平,D、E、F各組與C組相比,D、E、F組TNF-α、IFN-γ分泌明顯減低(P<0.05),IL-4、IL-10增高(P<0.05);F組TNF-α、IFN-γ濃度低于D和E組(P<0.05);D組IFN-γ濃度低于E組(P<0.05),但TNF-α在兩組內(nèi)差值無統(tǒng)計意義(P>0.05);F組IL-4、IL-1

11、0濃度高于D和E組(P<0.05);D組IL-10濃度高于E組(P<0.05),兩組IL-4無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1、HBO暴露后小鼠白細(xì)胞總數(shù)無明顯變化,外周血中Sca-1+/CD34+造血干/祖細(xì)胞增加,表明HBO對外周血干/祖細(xì)胞有動員作用,但與G-CSF無明顯協(xié)同作用。HBO暴露后小鼠脾臟縮小,脾臟細(xì)胞得率下降,說明HBO對免疫系統(tǒng)有一定抑制作用。HBO暴露后小鼠骨髓中氧含量升高,骨髓細(xì)胞得率無