GTPase蛋白R(shí)SA-14-44的功能研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜且高度有序的動(dòng)態(tài)過(guò)程，其間生精干細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂、減數(shù)分裂、核濃縮、細(xì)胞變形、激活等眾多復(fù)雜的變化，最終發(fā)育、分化成為成熟的精子。這些不同的細(xì)胞事件既相對(duì)獨(dú)立、相互區(qū)別，同時(shí)又相互關(guān)聯(lián)、相互銜接，整合成為一個(gè)系統(tǒng)、高效并且可控的有機(jī)整體。為確保種群的繁衍和物種的進(jìn)化，生命體逐漸發(fā)展出一整套精密、復(fù)雜的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)整個(gè)精子發(fā)生過(guò)程。其中一個(gè)很重要的方面就是依據(jù)不同發(fā)育階段的需要，在時(shí)間和空間上對(duì)精子發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)

2、行嚴(yán)密的控制。因此，分離、克隆不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因，深入研究它們?cè)诰影l(fā)生過(guò)程中所發(fā)揮的作用，對(duì)于揭示精子發(fā)生機(jī)理和促進(jìn)人類生殖健康均具有重要意義。 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，我們利用激光捕獲顯微切割技術(shù)(LaserCaptureMicrodissection，LCM)，成功地捕獲了大鼠的初級(jí)精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞；通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)(SuppressiveSubstractiveHybridization，SSH)構(gòu)建

3、圓形精子細(xì)胞消減初級(jí)精母細(xì)胞的消減cDNA文庫(kù)(RSA)，并從中篩選出差異表達(dá)基因。本研究中所涉及的RSA-14-44/mRSA-14-44就是通過(guò)上述篩選所得到的一個(gè)新基因，其所對(duì)應(yīng)的原始克隆編號(hào)為14-44，因此命名為RSA-14-44。該基因的GenBank登錄號(hào)為AY149343；編碼序列長(zhǎng)度為582bp，編碼一個(gè)由193個(gè)氨基酸組成并具有Rho-GTPase保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，RSA-14-4

4、4的氨基酸序列與RhoGTPase家族中的RhoAlike亞家族成員高度同源。同時(shí)，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化的GST-RSA-14-44蛋白具有GTPase活性。因此，確定RSA-14-44是RhoAlike亞家族的一個(gè)新成員。 針對(duì)RSA-14-44的多組織表達(dá)分析結(jié)果表明，該基因在大鼠睪丸組織中特異表達(dá)。對(duì)大鼠睪丸組織的免疫組織化學(xué)研究證實(shí)，RSA-14-44的表達(dá)與精子發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)；主要存在于除精原細(xì)胞外的各期生精細(xì)胞

5、中，特別是處于第一次減數(shù)分裂末期的初級(jí)精母細(xì)胞中。 利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)，在小鼠中找到一個(gè)RSA-14-44的同源序列基因4930544GllRik(GeneID:67653)。二者所編碼的蛋白質(zhì)序列高度同源，相似度達(dá)95.3％，并且具有相同的睪丸組織表達(dá)特異性。因此，我們確認(rèn)該基因是RSA-14-44的小鼠同源基因，并將其命名為mRSA-14-44。 在前期工作中，我們利用酵母雙雜交技術(shù)篩選睪丸組織中可

6、能存在的與RSA-14-44相互作用的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示蛋白酶體的組成蛋白PSMB5與RSA-14-44之間存在相互作用。利用GST-pulldown的方法，我們證實(shí)RSA-14-44與PSMB5之間存在相互作用。同時(shí)，我們還構(gòu)建了mRSA-14-44的真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了mRSA-14-44與PSMB5之間存在相互作用。 為明確RSA-14-44/mRSA-14-44在精子發(fā)生過(guò)程中的生物學(xué)功能，我們首先通過(guò)

7、免疫熒光觀察RSA-14-44和PSMB5在大鼠精子發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，二者在分離到的各期生精細(xì)胞中共定位，包括次級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞、長(zhǎng)形精子細(xì)胞和成熟的精子；二者的定位與整個(gè)精子發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)，隨著發(fā)育階段的不同產(chǎn)生相應(yīng)的變化。其次，蛋白酶體活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)在過(guò)表達(dá)RSA-14-441mRSA-14-44或共表達(dá)RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5的情況下，細(xì)胞的蛋白酶體活性并未發(fā)生顯著變化。此外

8、，我們還利用高通量篩選平臺(tái)對(duì)RSA-14-44/mRSA-14-44可能參與的細(xì)胞信號(hào)傳遞通路進(jìn)行鑒定。分析結(jié)果顯示，除CREB通路外，過(guò)表達(dá)RSA-14-44/mRSA-14-44對(duì)所選定的細(xì)胞信號(hào)通路并未產(chǎn)生顯著的影響。 為進(jìn)一步明確RSA-14-44/mRSA-14-44與PSMB5相互作用同RSA-14-44/mRSA-14-44蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了分別針對(duì)RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5

9、的突變體蛋白表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)免疫共沉淀和甘油密度梯度分離細(xì)胞組分來(lái)進(jìn)行相應(yīng)研究。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RSA-14-44/mRSA-14-44與PSMB5之間存在的相互作用并不依賴于RSA-14-44/mRSA-14-44的激活；同時(shí)也不依賴于RSA-14-44/mRSA-14-44中的效應(yīng)蛋白結(jié)合區(qū)、高可變區(qū)結(jié)構(gòu)；但位于CAAXmotif的190位Cysteine對(duì)維持二者間的相互作用至關(guān)重要。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示RSA-14-44/mRSA

10、-14-44中的C190位點(diǎn)可能存在棕櫚?；?palmitoylation)修飾。 另一方面，利用甘油密度梯度離心分離不同的細(xì)胞組分，分析其中RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5的分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞中的PSMB5以前體形式合成，其N-terminal包含propeptide結(jié)構(gòu)，需要經(jīng)過(guò)自剪切加工移除propeptide，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨问降腜SMB5；二者存在于不同的細(xì)胞組分之中，成熟體形式PSMB5與蛋白酶體

11、的另一個(gè)非催化亞單位PSMA7共存于沉降系數(shù)較大的細(xì)胞組分，前體形式的：PSMB5主要與RSA-14-44/mRSA-14-44共存于沉降系數(shù)較小的細(xì)胞組分。 在上述研究的基礎(chǔ)上，我們還進(jìn)一步探討了RSA-14-44/mRSA-14-44對(duì)細(xì)胞中PSMB5加工過(guò)程的影響。分析結(jié)果顯示，在細(xì)胞中共表達(dá)RSA-14-44/mRSA-14-44和PSMB5能夠相應(yīng)提高其中前體形式和成熟體形式PSMB5的蛋白質(zhì)水平，但并不影響前體蛋白的