吞噬細胞抗菌能力不足對嬰幼鼠細菌易感性的影響.pdf

1、嬰幼兒免疫功能發(fā)育未完善，容易受到各種病原體入侵，感染是新生兒死亡的主要原因之一。吞噬作用是宿主固有免疫抵御外來入侵病原微生物的一個關(guān)鍵因素。專職的吞噬細胞包括巨噬細胞和中性粒細胞。由吞噬細胞引起的吞噬作用和隨后的病原體降解在宿主應(yīng)對微生物感染的固有免疫中發(fā)揮了樞紐的作用。本文將通過對嬰幼鼠吞噬細胞殺菌功能及吞噬體成熟機制的研究，進一步闡明嬰幼鼠在面對細菌感染時為何較成年鼠更為敏感。
　　第一部分：小鼠細菌感染后的反應(yīng)差異

2、　　目的：通過小鼠膿毒癥模型，觀察成年鼠和嬰幼鼠細菌感染后，其生存情況，炎癥因子的釋放和器官細菌清除率的異同，明確嬰幼鼠是否較成年鼠對細菌感染更敏感。
　　方法：分別向2周和8周齡的C57BL/6嬰幼鼠和成年鼠腹腔注射1.25×109CFU/kg的活革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌或2.5×108CFU/kg的活革蘭氏陰性菌傷寒沙門氏菌。觀察小鼠生存率，繪制生存曲線；同時視網(wǎng)膜動脈取血，測量不同時間點外周血TNF-α和IL-6濃度水平，

3、并取外周血和肝，脾，肺等組織，研磨成勻漿后涂板計數(shù)細菌菌落。
　　結(jié)果：1）腹腔注射活金黃色葡萄球菌后，至觀測期結(jié)束時，嬰幼鼠較成年鼠存活率明顯降低（p=0.0094）。而注射活傷寒菌后，嬰幼鼠死亡率較成年鼠更高（p=0.0062）。
　　2）經(jīng)流式細胞儀檢測，2h和6h后，外周血TNF-α和IL-6濃度水平分別達到峰值，而嬰幼鼠較成年鼠有所降低，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3）腹腔注射活菌后24小時，嬰幼鼠外周血，肝，脾

4、及肺內(nèi)菌落計數(shù)均較成年鼠增多（p＜0.05），而48小時后，菌落計數(shù)增多更明顯（p＜0.05）。
　　結(jié)論：在應(yīng)對革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染時，嬰幼鼠均表現(xiàn)出細菌清除功能的受損，與死亡率升高的結(jié)果相符。
　　第二部分：細菌感染時小鼠中性粒細胞趨化性的研究
　　目的：通過檢測嬰幼鼠和成年鼠腹腔注射革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌后腹腔中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量變化，及中性粒細胞趨化性的變化，明確嬰幼鼠中所觀察到的推遲的細菌清

5、除的可能的原因。
　　方法：1）分別向2周和8周齡的C57BL/6嬰幼鼠和成年鼠腹腔注射1.25×109CFU/kg的活革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌或2.5×108CFU/kg的活革蘭氏陰性菌傷寒沙門氏菌。檢測腹腔灌洗液中中性粒細胞和巨噬細胞比率；
　　2）分離和純化的中性粒細胞，檢測其表面趨化性受體CXCR2，并在添加或不添加趨化誘導(dǎo)劑CXCL2后，評估中性粒細胞趨化性；
　　3）檢測GRK2在細菌感染時的作用。

6、>　　結(jié)果：1）感染金葡菌和傷寒沙門氏菌12小時和24小時后，成年鼠腹腔中性粒細胞明顯增加。相反，嬰幼鼠在應(yīng)對細菌感染時，招募至腹腔的中性粒細胞明顯減少（p＜0.05），而腹腔巨噬細胞數(shù)在成年鼠和嬰幼鼠無明顯差異；
　　2）嬰幼鼠中性粒細胞CXCR2構(gòu)成性表達較成年鼠少（p＜0.05），而感染后，成年鼠中性粒細胞CXCR2表達下調(diào)，而嬰幼鼠的下降更明顯（p＜0.05），與CXCR2表達降低相似，無論感染或非感染時，嬰幼鼠均表現(xiàn)出趨

7、化物CXCL2的明顯降低（p＜0.05）；
　　3）不論是否經(jīng)細菌刺激，成年鼠與嬰幼鼠GRK2表達均沒有區(qū)別，而加入GRK2的抑制劑后，雖然趨化物CXCL2在經(jīng)TLR4的拮抗劑LPS和TLR2拮抗劑BLP刺激后表達上調(diào)，但是嬰幼鼠中性粒細胞上CXCL2仍然低表達于成年鼠（p＜0.05）。
　　結(jié)論：1）細菌感染時，嬰幼鼠外周血循環(huán)中中性粒細胞向感染處的遷移不足；
　　2）嬰幼鼠中性粒細胞表面趨化性受體CXCR2表達少，

8、而感染后，其表達進一步下降；
　　3）GRK2表達與中性粒細胞表面受體CXCR2和趨化性降低無關(guān)。
　　第三部分：小鼠吞噬受體表達和吞噬細胞胞內(nèi)細菌殺傷能力研究
　　目的：通過檢測吞噬細胞表明吞噬受體表達情況，以及胞內(nèi)細菌殺傷能力，進一步闡明嬰幼鼠對細菌感染的敏感性增強和細菌清除能力的延遲。
　　方法：1）流式細胞儀同時檢測嬰幼鼠和成年鼠巨噬細胞和中性粒細胞表面兩種吞噬受體，補體受體3（CR3）和FcγIII/I

9、I受體（FcγR）的表達情況，并檢測經(jīng)LPS和BLP刺激后巨噬細胞兩種吞噬受體表達情況；
　　2）將PE標(biāo)記金黃色葡萄球菌或傷寒沙門氏菌與小鼠中性粒細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)，15和30分鐘后流式細胞儀檢測，吞噬細胞內(nèi)細菌熒光強度；
　　3）將活金黃色葡萄球菌或傷寒沙門氏菌按20:1的比例與小鼠中性粒細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)，30和60分鐘后溶解細胞計數(shù)細菌菌落生長數(shù)，計算胞內(nèi)細菌殺傷率。
　　結(jié)果：1）嬰幼鼠巨噬細胞和中性粒細

10、胞上CR3表達較成年鼠明顯降低（p＜0.05），但FcγR降低不明顯。以LPS或BLP刺激后，嬰幼鼠巨噬細胞CR3表達上調(diào)較成年鼠弱（p＜0.05）；
　　2）嬰幼鼠中性粒細胞和巨噬細胞對細菌吞噬能力與成年鼠無明顯差別；
　　3）嬰幼鼠中性粒細胞和巨噬細胞對細菌胞內(nèi)殺傷能力明顯較成年鼠降低（p＜0.05）。
　　結(jié)論：嬰幼鼠吞噬細胞以吞噬受體表達和胞內(nèi)細菌殺傷能力降低為特征。
　　第四部分：小鼠吞噬體成熟過程的研

11、究
　　目的：通過比較成年鼠和嬰幼鼠吞噬體酸化過程中pH值變化，及吞噬溶酶體融合程度，探討嬰幼鼠吞噬體成熟是否存在缺陷。
　　方法：1）采用腹腔灌洗法分離和純化小鼠腹腔巨噬細胞，按1:20（細胞數(shù)：細菌數(shù)）比例分別與雙標(biāo)記有fluorescein-SE（pH-敏感性熒光探針）和rhodamine-SE（pH-非敏感性熒光探針）的革蘭氏陽性金葡球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌共同孵育，細胞流式儀測定孵育0、5、10、15、20、25

12、、30分鐘巨噬細胞吞噬體內(nèi)pH（酸化）值的變化；
　　2）將腹腔巨噬細胞裝載LysoTrackerred以標(biāo)記內(nèi)涵溶酶體，以檢測隨著時間變化吞噬體與LysoTrackerred共區(qū)域化程度，從而監(jiān)測攝取FICT標(biāo)記的金葡菌后吞噬體的成熟過程。
　　結(jié)果：1）嬰幼鼠巨噬細胞在攝取金葡菌和傷寒菌后，吞噬體酸化較成年鼠明顯延遲和降低（p＜0.05）。
　　2）60分鐘后，成年鼠巨噬細胞內(nèi)，攝取的FITC標(biāo)記的金葡菌幾乎全部與