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文檔簡介
1、第一部分:體內(nèi)實驗肥胖大鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變及缺血/再灌注易損性研究
目的:作為冠心病的重要危險因素,肥胖是目前全世界面臨的公共衛(wèi)生難題。然而,傳統(tǒng)的觀察研究卻發(fā)現(xiàn)那些已經(jīng)罹患冠心病的肥胖患者生存率更高,這就是所謂的“肥胖悖論”。肥胖真的對冠心病的預(yù)后有保護作用嗎?本研究擬驗證肥胖大鼠是否對急性心肌缺血/再灌注損傷更為易感,并探討其可能的分子機制。
方法:64只4~6周齡的雄性wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周以后隨機
2、分為兩組,其中對照組(n=32)給予正常飼料喂養(yǎng)、肥胖組(n=32)給予高脂飼料喂養(yǎng),高脂飼料中含有1%的膽固醇和15%的豬油,24周后肥胖動物模型建成。其中,第12周末對照組剔除肥胖易感大鼠(6只),肥胖組剔除肥胖抵抗大鼠(7只)。24周內(nèi),密切隨訪大鼠的體重和身長。分別在12周末和24周末檢查大鼠的血糖、血脂并用心超評價心臟結(jié)構(gòu)和功能。然后通過阻斷冠狀動脈前降支的方法建立急性心肌缺血/再灌注損傷模型(對照組n=12只建模成功8只,肥
3、胖組n=15只建模成功12只),其中缺血時間30分鐘、再灌注時間120分鐘。實驗過程中監(jiān)測大鼠的血流動力學(xué)參數(shù)以及心律失常的發(fā)生率,實驗結(jié)束后以伊文氏藍和TTC分別染色,計算缺血面積和梗死面積。未行缺血/再灌注損傷的大鼠予以處死,留取標(biāo)本進行HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)、TUNEL染色觀察細胞凋亡,透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變以及提取總RNA用以逆轉(zhuǎn)錄并以實時熒光定量PCR對caveolin-3和KATP各亞單位的mRNA水平進行定量,提取
4、蛋白質(zhì)并以western-blot檢測caveolin-3和KATP各亞單位在細胞膜和胞漿表達量。對照研究兩組大鼠的差異性。
結(jié)果:肥胖大鼠的體重、身長、體質(zhì)指數(shù)均較對照組明顯升高,12周末其生化指標(biāo)空腹血糖、低密度脂蛋白及總膽固醇就開始出現(xiàn)顯著差異。盡管心超檢查提示肥胖大鼠的左房內(nèi)徑和左室后壁厚度較對照組增加,二者有統(tǒng)計學(xué)差異(24周p<0.01),但是肥胖大鼠的射血分數(shù)和左室短軸縮短率較對照組相比無明顯改變。它們的每搏輸出
5、量和每分鐘輸出量的差別經(jīng)過體重校正以后也沒有差異。但是心肌結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)心肌的脂質(zhì)沉積以及心肌細胞的凋亡率在肥胖大鼠心肌開始增加,透射電鏡檢查甚至發(fā)現(xiàn)部分小窩結(jié)構(gòu)破壞。心肌缺血/再灌注過程中,肥胖大鼠的耐受性明顯降低,表現(xiàn)為比對照組更高的死亡率、嚴(yán)重的血流動力學(xué)障礙、室性心律失常增加。盡管實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠的caveolin-3和KATP各亞單位的mRNA水平較對照組明顯增加,但是western-blot和免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)ca
6、veolin-3在細胞膜上的定位明顯減少,western-blot發(fā)現(xiàn)kir6.2在細胞膜上的表達也在減少。
結(jié)論:通過高飽和脂肪酸飲食喂養(yǎng)wistar大鼠可以建立肥胖動物模型。經(jīng)過24周的喂養(yǎng),盡管肥胖大鼠的心功能仍然處于代償狀態(tài),但是心肌重構(gòu)明顯,經(jīng)過缺血/再灌注損傷以后,血流動力學(xué)參數(shù)明顯下降同時伴有惡性心律失常和心梗面積增加,提示肥胖可能導(dǎo)致機體內(nèi)源性防御機制受損,心肌缺血/再灌注耐受性下降、易感性增加。caveoli
7、n-3和Kir6.2在細胞膜上的定位減少可能是高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠心肌重構(gòu)并對缺血/再灌注損傷易感性增加的原因。
第二部分:離體實驗棕櫚酸對H9C2心肌細胞缺氧/復(fù)氧耐受性的影響及機制探討
目的:在體實驗證實,肥胖導(dǎo)致的心肌重構(gòu)削弱了心肌對缺血/再灌注損傷的內(nèi)源性保護作用。但是肥胖導(dǎo)致心肌重構(gòu)的機制非常復(fù)雜,也很難闡明是哪一種機制對缺血/再灌注損傷(MIRI)起作用。我們假定是肥胖個體的心肌能量代謝障礙對MIRI起主
8、要作用。以此建立體外模型觀察研究。
方法:已有研究證實棕櫚酸可以通過刺激細胞產(chǎn)生活性氧簇(ROS)誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,所以本研究給以較低劑量的棕櫚酸(0.25mmol/L)干預(yù)H9C2心肌細胞,然后給予物理性的缺氧/復(fù)氧損傷過程(2小時/24小時)處理,使用CCK-8試劑盒觀察細胞增殖個數(shù),JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒觀察細胞的線粒體膜電位耗散情況,并以AnnexinⅤ/PI染色流式細胞學(xué)技術(shù)分析細胞的凋亡程度。同樣使用qPC
9、R技術(shù)對照研究棕櫚酸-氫氧化鉀組和氫氧化鉀組H9C2心肌細胞caveolin-3和KATP各亞單位的mRNA水平;western-blot驗證caveolin-3和Kir6.2在細胞膜上的定位情況有無差異,增加測定兩組心肌細胞線粒體蛋白中凋亡家族基因bax/bcl-2的蛋白質(zhì)表達水平。為驗證是否存在KATP的功能障礙,予以加用KATP開放劑二氮嗪預(yù)處理后進一步觀察對H9C2心肌細胞增殖和凋亡的影響。
結(jié)果:棕櫚酸抑制了H9C2
10、心肌細胞缺氧/復(fù)氧過程中的增殖水平,同時通過降低線粒體膜電位水平誘導(dǎo)細胞凋亡率比氫氧化鉀組增加。離體實驗中棕櫚酸干預(yù)過的H9C2心肌細胞caveolin-3和KATP各亞單位mRNA水平均較對照組明顯增加,這與在體實驗的結(jié)果基本一致。但是western-blot只發(fā)現(xiàn)棕櫚酸干預(yù)后caveolin-3的膜定位減少。同時,棕櫚酸干預(yù)后線粒體凋亡基因蛋白質(zhì)Bax/bcl-2的比值明顯較氫氧化鉀組上調(diào),提示細胞凋亡通過線粒體凋亡通路。二氮嗪預(yù)處
11、理可以在一定程度上改善棕櫚酸預(yù)處理組H9C2心肌細胞的增殖水平、維持線粒體膜電位、減少細胞凋亡,但是對caveolin-3的定位沒有影響,對氫氧化鉀組細胞增殖和線粒體膜電位也無影響。同時棕櫚酸組與氫氧化鉀組平行對照研究發(fā)現(xiàn)即使加入二氮嗪預(yù)處理,二者之間仍然存在顯著差異。
結(jié)論:離體實驗基本復(fù)制了在體實驗中肥胖對心肌缺血/再灌注損傷的結(jié)果,心肌飽和脂肪酸代謝所致的線粒體膜電位下降與caveolin-3定位異常有關(guān),同時經(jīng)過線粒體
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