二氫生物蝶呤還原酶下調(diào)TGFβ1-Smad3信號傳導(dǎo)通路參與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的實驗研究.pdf

1、多項流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已成為全球慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)和終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要構(gòu)成原因。DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，仍未完全闡明，目前認(rèn)為DN的發(fā)生與多元醇通路激活、氧化應(yīng)激、血流動力學(xué)改變、多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)及遺傳等多種因素密切相關(guān)。其中轉(zhuǎn)化生長因子(transforming gro

2、wth factor betal，TGF-β1)的表達(dá)增多是DN發(fā)生發(fā)展的重要因素，它可以誘導(dǎo)系膜外基質(zhì)增加以及氧化應(yīng)激反應(yīng)從而促進(jìn)腎小球硬化和纖維化。而TGF-β1作用于效應(yīng)細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過激活Smad3通路實現(xiàn)。
　　 課題組在前期差異蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)現(xiàn)，二氫生物喋呤還原酶(dihydropteridinereductase，QDPR)在自發(fā)性Ⅱ型糖尿病模型OLETF大鼠腎臟損害時，編碼此蛋白的基因發(fā)生了點突變，QDP

3、R的主要功能是促進(jìn)四氫生物喋呤(tetrahydrobiopterin，BH4)再生，而BH4又是3種一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)生成的輔助因子繼而會影響一氧化氮的合成。一氧化氮(nitric oxide，NO)在體內(nèi)有著廣泛的生理作用，在糖尿病腎病發(fā)病過程中它參與了腎小球硬化和氧化應(yīng)激狀態(tài)的形成過程，機(jī)制與調(diào)節(jié)TGFβ1的生成，舒張血管，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶活性等有關(guān)。

4、QDPR作為調(diào)節(jié)體內(nèi)BH4水平的關(guān)鍵代謝酶，在DN發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明確。目前還沒有文獻(xiàn)報道QDPR與DN發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。本研究通過觀察QDPR在糖尿病腎病大鼠中的表達(dá)水平，以及野生型和突變型QDPR對TGFβ1/Smad3信號通路的影響，深入揭示了DN的發(fā)病機(jī)制，為探索藥物的作用靶點提供線索，研究思路具有較強(qiáng)的新穎性。
　　 目的:
　　 探討二氫生物喋呤還原酶（dihydropteridine reductas

5、e，QDPR）是否能通過TGF-β1/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程，為進(jìn)一步深入了解DN的發(fā)生發(fā)展過程并為其分子診斷和基因治療提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.QDPR在1型糖尿病腎病大鼠模型腎皮質(zhì)中表達(dá)變化的研究
　　 本部分研究首先制備了鏈脲佐菌素腹腔注射合并單側(cè)腎切除誘導(dǎo)的1型糖尿病腎病的動物模型，20周后將動物處死取腎皮質(zhì)提取總RNA及蛋白，然后采用RT-PCR和Weste

6、rn blot方法檢測正常Wistar大鼠以及模型組大鼠腎皮質(zhì)QDPR的表達(dá)變化，此外我們還檢測了正常組和模型組TGF-β1，Smad3和NOXs基因和蛋白水平的變化。
　　 2.野生型QDPR基因?qū)GFβ1/Smad3信號通路的影響
　　 本部分研究通過構(gòu)建野生型QDPR重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，觀察了在QDPR高表達(dá)時TGF-β/Smad通路以及相關(guān)基因的變化，質(zhì)粒構(gòu)建的具體步驟如下:根據(jù)GeneBank中大鼠QDPR

7、 mRNA序列設(shè)計引物，上游引物引入EcoR V酶切位點，下游引物引入XbaⅠ酶切位點，以正常LETO大鼠腎臟皮質(zhì)cDNA為模板，采用高保真PCR試劑盒擴(kuò)增野生型QDPR cDNA片段，對PCR產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，分離后克隆至pUM-T載體并測序，然后亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His，酶切鑒定后測序，如果測序結(jié)果正確則證明QDPR/pcDNA3.1/V5-His(rQDPR)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。隨后用磷

8、酸鈣共沉淀法瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞建立QDPR高表達(dá)的細(xì)胞模型，以空載體(control vector)作為對照，轉(zhuǎn)染72h后收集細(xì)胞上清和細(xì)胞蛋白，先用Western blot方法來驗證融合蛋白在細(xì)胞中是否成功表達(dá)，再采用Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測當(dāng)QDPR過表達(dá)時三種NOS，TGF-β/Smad通路，NADPH氧化酶各亞基的表達(dá)量，此外，用ELISA技術(shù)檢測BH4在空載體和rQDPR組中的含量。
　　

9、 另一方面，我們通過敲降實驗觀察了QDPR在低表達(dá)時TGF-β等基因的變化。具體步驟如下:我們首先將QDPR mRNA的序列給公司，隨后吉瑪公司設(shè)計了3種大鼠QDPR基因siRNA Oligo干擾序列，分別為 QDPR1:GCCAGCGUGAUUGUUAAGATT UCUUAACAAUCACGCUGGCTT; QDPR2:CCAAAUCCAAGUCACUCUUTT AAGAGUGACUUGGAUUUGGTT; QDPR3:AGCCUUG

10、CAGGGAAGAACATT UGUUCUUCCCUGCAAGGCUTT。每段序列加入150ul水配置成20uM的溶液，分別取4ug和野生型rQDPR重組質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞上清以及細(xì)胞，檢測TGF-β1以及NADPH氧化酶各亞基的含量。
　　 3.突變型QDPR對TGF-β1/Smad通路及自噬作用的影響
　　 本部分研究通過構(gòu)建突變型QDPR重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，觀察了在QDPR基因突變時

11、TGF-β/Smad通路以及相關(guān)基因的變化，質(zhì)粒構(gòu)建的具體步驟如下:根據(jù)GeneBank中大鼠QDPR mRNA序列設(shè)計引物，上游引物引入EcoRV酶切位點，下游引物引入XbaⅠ酶切位點，以O(shè)LETF2型糖尿病自發(fā)性大鼠的腎臟皮質(zhì)cDNA為模板，采用高保真PCR試劑盒擴(kuò)增突變型QDPR cDNA片段，對PCR產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，-20℃保存。用T4 DNA連接酶連接目的片段與載體，構(gòu)建QDPR(mut)/pcDNA3.

12、1/V5-His(rQDPR(mut))重組質(zhì)粒。隨后用磷酸鈣共沉淀法瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，實驗分為空載體組(control vector)，野生型rQDPR組，和突變型rQDPR(mut)組，轉(zhuǎn)染72h后收集細(xì)胞上清和細(xì)胞蛋白，先用Westernblot方法來驗證融合蛋白在細(xì)胞中是否能成功表達(dá)，再采用Western blot和RT-PCR技術(shù)研究野生型和突變型QDPR對三種NOS，TGF-β/Smad通路，NADPH氧化酶各亞基

13、的影響，此外，用ELISA技術(shù)來檢測三組中BH4的含量。
　　 此外，我們還將野生型和突變型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞觀察了QDPR對自噬相關(guān)基因的影響，具體實驗步驟如下:將成功構(gòu)建好的野生型和突變型QDPR重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至正常培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞，研究分為空載體組(control vector)，野生型rQDPR組，和突變型rQDPR(mut)三組，轉(zhuǎn)染72h后，采用RT-PCR及Western blot方法檢測空載體組，野生型

14、QDPR組和突變型QDPR組自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1的表達(dá)量變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.QDPR在STZ+單側(cè)腎切誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟的表達(dá)研究:造模成功后，即實驗第0周模型組大鼠血糖與空白組相比顯著升高(P＜0.01)，在之后的第4，8，12，16，20周各時間點均與空白組有極顯著差異，均為P＜0.01;在尿蛋白方面我們發(fā)現(xiàn)與空白組比較，模型組尿蛋白在實驗第20周時顯著升高(P＜0.01)。20周齡Wist

15、ar大鼠以及單側(cè)腎切除合并鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)的1型DN大鼠腎皮質(zhì)與正常Wistar大鼠相比，QDPR的mRNA及蛋白的水平都有所降低，TGF-β1，Smad3和NADPH氧化酶亞基的基因和蛋白水平都有所升高，提示在糖尿病腎病狀態(tài)下QDPR的功能受損并影響了下游的一些蛋白和基因的表達(dá)。
　　 2.野生型QDPR對TGFβ1/Smad3信號通路的影響:酶切和測序結(jié)果都顯示QDPR的cDNA序列正確，測序正確后將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

16、染至293T細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)融合蛋白在細(xì)胞中能成功表達(dá)，并且與空載體對照組相比，QDPR高表達(dá)組TGF-β1和Smad3的基因和蛋白水平以及NADPH氧化酶亞基NOX1，NOX4的表達(dá)都有所降低，而nNOS的基因水平與BH4的含量在QDPR高表達(dá)時有所升高，初步推測QDPR的高表達(dá)影響了這些蛋白和基因的變化。
　　 此外，將設(shè)計的三對siRNA序列與野生型QDPR重組質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，Western blot結(jié)果顯示

17、有一條siRNA序列的基因敲除率達(dá)80％，可用于下一步研究，在隨后的結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，QDPR基因被敲除后，TGF-β1的表達(dá)相應(yīng)升高，以及NOX1，NOX4的表達(dá)都有所升高。RNAi結(jié)果更證實了QDPR基因有下調(diào)TGF-β1表達(dá)的功能。
　　 3.突變型QDPR對TGF-β1/Smad通路及自噬作用的影響:在質(zhì)粒構(gòu)建中，測序結(jié)果顯示突變型QDPR的cDNA序列與基因組的序列對比在93位氨基酸的位置突變，測序后將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

18、染至293T細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)融合蛋白在細(xì)胞中能成功表達(dá)，表明我們成功構(gòu)建了突變型QDPR重組質(zhì)粒，在進(jìn)一步的檢測中我們發(fā)現(xiàn)，與野生型QDPR重組質(zhì)粒組相比，QDPR基因點突變后TGF-β1和Smad3的基因和蛋白水平以及NADPH氧化酶亞基的表達(dá)都明顯增加，而nNOS的基因水平與BH4的含量卻沒有明顯變化。
　　 此外，突變型研究中我們還描述了QDPR基因突變后對HEK293T細(xì)胞自噬相關(guān)基因的影響。RT-PCR結(jié)果顯示，與空載體組

19、相比，野生型QDPR組LC3基因水平明顯上調(diào)(P＜0.05)，突變型QDPR組LC3基因水平與空載體組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;與空載體組相比，野生型和突變型Beclin1基因水平無統(tǒng)計學(xué)差異;Western blot結(jié)果顯示，與空載體組相比，野生型QDPR組LC3-Ⅱ和Beclin1的蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)(P＜0.05)，而LC3-Ⅰ的蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.QDPR的表達(dá)量在Ⅰ型糖尿病腎病大鼠的腎皮質(zhì)

20、明顯降低，提示糖尿病腎病的發(fā)生影響了QDPR的功能，由此我們推測QDPR可能參與了糖尿病腎病的發(fā)病過程并在其中有重要作用。
　　 2.野生型QDPR重組質(zhì)粒細(xì)胞實驗結(jié)果顯示 QDPR蛋白可以通過影響B(tài)H4來調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路的變化。對于QDPR基因功能的深入研究將有助于揭示DN腎小球硬化的分子生物學(xué)機(jī)制，為研究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。
　　 3.突變型QDPR重組質(zhì)粒細(xì)胞實驗結(jié)果顯示 QDPR基