預(yù)后營養(yǎng)指數(shù)對惡性胸膜間皮瘤預(yù)后的影響及黃連素誘導(dǎo)其凋亡、自噬的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)是一種惡性程度高、較為罕見的腫瘤，環(huán)境的石棉暴露是主要的致病因素。雖然近些年來石棉的使用量在世界范圍內(nèi)減少，但是由于其潛伏期長（約20-40年），本病的發(fā)病率仍在持續(xù)上升。MPM預(yù)后不良，其確診后中位生存期約12個月，關(guān)于MPM的預(yù)后分析，國內(nèi)缺乏大宗的病例報道，數(shù)據(jù)主要來源于國外。因此，本課題在第一部分首先回顧性分析了121例病

2、理確診為MPM的患者的臨床病理特征并對其隨訪資料進行生存分析，研究治療前預(yù)后營養(yǎng)指數(shù)(prognostic nutritional index，PNI)與患者臨床病理特點、預(yù)后的相關(guān)性，探討PNI在判定MPM預(yù)后中的作用和臨床意義。
　　MPM的治療方法主要有手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療以及三峰治療等方法，但是效果均不理想，盡管目前培美曲塞聯(lián)合應(yīng)用鉑類制劑的一線化療方案或三峰治療取得了一定的臨床效果，可以改善患者的生存率，但是仍然

3、缺乏理想的療效，且化療毒副作用較大，目前仍無統(tǒng)一的治療方法。因此亟需尋找新型有效且毒副作用低的治療方法。
　　黃連素是一種從黃連、三顆針、黃柏等植物中提取出來的異喹啉生物堿，它具有廣泛的藥理學(xué)作用。近年來，有研究表明其具有顯著的抗腫瘤作用，已經(jīng)在肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌等腫瘤中得到證實。黃連素主要是通過抑制腫瘤細胞增殖，調(diào)控細胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等方式來發(fā)揮作用。另外，近來有報道，黃連素可以通過誘導(dǎo)

4、細胞自噬發(fā)揮抗腫瘤的作用。但是目前仍未有黃連素在間皮瘤治療中的報道。因此本課題的第二部分應(yīng)用體外實驗研究黃連素對人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞的作用，并進一步探討凋亡和自噬在黃連素治療間皮瘤過程中的作用及相關(guān)分子機制。
　　第一部分:預(yù)后營養(yǎng)指數(shù)與惡性胸膜間皮瘤預(yù)后的相關(guān)性研究
　　目的:
　　本部分研究通過對121例MPM患者的臨床病理特點及隨訪資料進行生存分析，研究治療前PNI與患者的臨床病理特點、預(yù)后的相關(guān)性

5、，探討PNI在判定MPM預(yù)后中的作用和臨床意義。
　　方法:
　　2001年10月-2013年1月間于山東省立醫(yī)院呼吸科、齊魯醫(yī)院呼吸科、山東省胸科醫(yī)院結(jié)核科行內(nèi)科胸腔鏡檢查病理診斷為MPM的患者121例，收集患者的臨床病理及實驗室資料，并對患者進行隨訪，收集隨訪資料。PNI計算公式為:10×血清白蛋白值(g/dl)+0.005×外周血淋巴細胞計數(shù)（/mm3）。應(yīng)用單因素及多因素生存分析，檢測PNI及各項臨床病理參數(shù)對預(yù)后的

6、影響。
　　結(jié)果:
　　1.全組患者平均PNI值為44.6±6.3，PNI與年齡、吸煙史及體重減輕明顯相關(guān)(P＜0.05)。
　　2.本研究將PNI的平均值44.6作為界值將全組患者分為兩組:低PNI組(PNI＜44.6;n=60;49.6％)及高PNI組(PNI≥44.6;n=61;50.4％)。截止到最后隨訪時間，121例患者中，有77例(66.3％)死亡，其中高PNI組31例，低PNI組46例。全組患者的中位累積

7、生存時間為15個月（0.386個月）。低PNI患者中位累積生存時間為11個月，明顯短于高PNI患者的18個月，低PNI患者的1年及2年總生存率分別低于高PNI患者的1年總生存率(45.5％VS72.3％)及2年總生存率（18.4％VS38.7％;Kaplan-Meier法、Log-rank檢驗P=0.003）。
　　3.低PNI患者較高PNI患者有更高的死亡風(fēng)險(HR[hazard ratio]:2.290;95％CI[confi

8、dence interval]:1.415-3.706;P=0.001)。
　　結(jié)論:
　　PNI是判定MPM總生存率的獨立預(yù)后因素，低PNI患者較高PNI患者有更高的死亡風(fēng)險。
　　第二部分:黃連素誘導(dǎo)人胸膜間皮瘤細胞凋亡與自噬及分子機制研究
　　目的:
　　研究黃連素對人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞的作用，并進一步探討凋亡和自噬在黃連素治療間皮瘤過程中的作用及相關(guān)分子機制。
　　方法:

9、　　一、黃連素誘導(dǎo)人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞凋亡作用的研究
　　不同濃度黃連素干預(yù)人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞系，應(yīng)用MTT法檢測細胞的增殖活性;應(yīng)用Hoechst33258染色及AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡;應(yīng)用western blot分析黃連素誘導(dǎo)NCI-H2452細胞凋亡的分子機制。
　　二、黃連素誘導(dǎo)人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞自噬作用的研究
　　黃連素作用于人胸膜間

10、皮瘤NCI-H2452細胞系，應(yīng)用免疫熒光法檢測細胞內(nèi)自噬特異性標記物L(fēng)C3的分布;應(yīng)用western blot探討黃連素誘導(dǎo)NCI-H2452細胞自噬相關(guān)蛋白的表達以及自噬抑制劑及自噬激動劑對黃連素誘導(dǎo)的自噬的影響。
　　三、自噬在黃連素誘導(dǎo)人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞死亡過程中的作用
　　應(yīng)用MTT法檢測自噬抑制劑3-MA抑制自噬后對黃連素引起的NCI-H2452細胞增殖抑制的影響;用凋亡抑制劑、自噬抑制劑、自噬激

11、動劑分別聯(lián)合黃連素干預(yù)間皮瘤細胞，然后應(yīng)用臺盼藍染色法探討黃連素誘導(dǎo)的間皮瘤細胞死亡過程中凋亡與自噬的作用;應(yīng)用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染法及western blot探討黃連素誘導(dǎo)間皮瘤NCIH2452細胞自噬與凋亡的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　一、黃連素誘導(dǎo)人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞凋亡作用的研究
　　1.黃連素可以顯著抑制NCI-H2452細胞增殖，呈劑量及時間依賴性。
　　2.Hoechst

12、33258染色及AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染法結(jié)果顯示黃連素可以誘導(dǎo)細胞的凋亡，與對照組比較，當用100μM的黃連素干預(yù)細胞48小時后，凋亡率由對照組的4.55±0.96％顯著上升至34.23±1.16％（P＜0.001）。
　　3.Westernblot結(jié)果顯示黃連素可能是通過caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性線粒體途徑促進間皮瘤細胞凋亡。
　　二、黃連素誘導(dǎo)人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞自噬作用的研究
　

13、　1.LC3免疫熒光可見LC3的分布由未處理組的廣泛彌漫型分布變?yōu)辄S連素處理組的核周針尖樣、顆粒樣分布。
　　2.黃連素增加LC3(II)的表達，下調(diào)p62的表達，并呈時間劑量依賴性。
　　3.3-MA可以抑制而雷帕霉素可以增加黃連素誘導(dǎo)的自噬。
　　三、自噬在黃連素誘導(dǎo)人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞死亡過程中的作用
　　1.黃連素以劑量依賴性殺死細胞，當黃連素濃度達到200μM干預(yù)細胞48小時時，細胞死亡率

14、達到34.66±5.32％(P＜0.001)。
　　2.抑制凋亡降低黃連素誘導(dǎo)的細胞死亡率，z-VAD-fmk能夠顯著逆轉(zhuǎn)黃連素誘導(dǎo)的NCI-H2452細胞死亡，說明凋亡參與黃連素誘導(dǎo)的細胞死亡。
　　3.抑制自噬增加、誘導(dǎo)自噬降低黃連素誘導(dǎo)的NCI-H2452細胞死亡率。
　　4.抑制自噬增加黃連素誘導(dǎo)的NCI-H2452細胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.黃連素可以誘導(dǎo)間皮瘤NCI-H2452細胞發(fā)生凋亡，

15、可能是通過caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性線粒體途徑促進間皮瘤細胞凋亡。
　　2.黃連素可以誘導(dǎo)間皮瘤NCI-H2452細胞發(fā)生自噬，下調(diào)p62蛋白表達。
　　3.凋亡是黃連素誘導(dǎo)的間皮瘤NCI-H2452細胞死亡的主要形式，自噬是一種應(yīng)激反應(yīng)，可能是通過阻止細胞凋亡而對細胞起到的一種保護作用，抑制自噬可以增加細胞凋亡，增強間皮瘤NCI-H2452細胞對黃連素的敏感性。
　　創(chuàng)新性和意義:
　　1.本課題首次發(fā)現(xiàn)P