DPP-4酶抑制劑對2型糖尿病大鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和occludin的調控與代謝性內毒素血癥的相關性研究.pdf

1、背景:
　　2型糖尿病是一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳性復雜疾病。近年來發(fā)病率逐年上升，嚴重危害了人類的身體健康并急劇加重了社會醫(yī)療成本。目前認為系統(tǒng)性（全身性）慢性炎癥在2型糖尿病的發(fā)病機制中發(fā)揮著極其重要的作用。
　　研究證實，腸道革蘭氏陰性桿菌的細胞壁成分脂多糖(LPS)誘導的全身系統(tǒng)性炎癥是2型糖尿病、肥胖等代謝性疾病發(fā)病機制中的重要因素。這種循環(huán)中的脂多糖水平較正常值高2-3倍的病理現(xiàn)象被定義為“

2、代謝性內毒素血癥”。內循環(huán)中增多的LPS不僅可以引起肝臟的炎癥，促進肝臟纖維化，還可以導致肌肉、脂肪等組織的炎癥，介導胰島素抵抗的產生。
　　在不良的生活方式如高脂飲食的影響下，脂質會在腸上皮間隙過度堆積，破壞腸道緊密連接結構，另外腸道微環(huán)境包括腸道菌群等的改變，還會觸發(fā)腸道炎癥，使得腸屏障功能受損，腸道通透性增加，從而導致LPS入血增多。提示腸黏膜屏障功能的損害是代謝性內毒素血癥發(fā)生機制中極其重要的環(huán)節(jié)。
　　在維持腸黏膜

3、屏障正常功能的諸多因素中，緊密連接(TJ)的作用十分重要，其不僅是腸上皮機械屏障的最重要的結構基礎，也是調節(jié)細胞旁物質轉運的限速步驟。緊密連接(TJ)主要由跨膜蛋白claudin、occludin和膜周蛋白zonulaoccludens(ZO)等組成，主要功能是維持腸上皮細胞的極性和調節(jié)腸道屏障的通透性，減少腸道大分子和微生物通過腸壁進入機體內環(huán)境。
　　益生元、益生菌等調節(jié)腸道菌群或改善腸道炎癥的手段可以通過減輕2型糖尿病或肥胖

4、大鼠的腸道緊密連接蛋白的損傷，減輕腸道炎癥，減少腸道LPS進入機體內環(huán)境。改善腸黏膜屏障功能，降低腸道通透性，減少腸道細菌代謝產物如脂多糖進入血循環(huán)目前被認為是改善諸如肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的一種新的治療策略。
　　胰高血糖素樣肽-2(glucagon-likepeptide-2，GLP-2)是腸道L細胞分泌的一種多肽類物質，也是腸上皮特異性生長因子，其促進腸黏膜生長的作用明顯強于其他腸上皮生長因子，對損傷的腸道上皮擁有強大

5、的修復功能，可以明顯上調腸上皮緊密連接蛋白的表達，顯著的改善腸黏膜屏障功能。同GLP-1類似，GLP-2也可以被DPP-4酶降解失活。
　　另外有研究表明，在介導代謝性炎癥及胰島素抵抗中擁有極其重要功能的蛋白酶激活受體2(protease activated receptors2，PAR2)，在促進腸道炎癥，誘導腸黏膜損傷方面也有著舉足輕重的作用。腸道激活的PAR2不僅可以誘導肥大細胞脫顆粒和激活核轉錄因子NF-κB，促進炎性因子

6、的釋放和炎性細胞的遷移浸潤，引起腸道黏膜的損傷，還可以通過激活胞漿中的ERK1/2，促使腸道緊密連接蛋白和其周圍肌動蛋白的重新分布，增加腸道通透性。
　　使用DPP-4酶抑制劑抑制腸道GLP-2的水解和PAR2的激活，可能會對2型糖尿病大鼠腸黏膜屏障功能起到保護作用，從而減少腸道LPS入血，減輕代謝性內毒素血癥。
　　本研究通過檢測2型糖尿病大鼠近端結腸緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達及門靜脈血漿LPS和相關炎癥

7、因子水平的變化，探討DPP-4酶抑制劑利格列汀對腸黏膜屏障及代謝性內毒素血癥的保護作用及其可能的機制，為挖掘DPP-4酶抑制劑降糖之外的作用、擴展DPP-4酶抑制劑在臨床的應用范圍以及治療肥胖及胰島素抵抗等相關疾病提供新的策略和依據(jù)。
　　方法:
　　30只SPF級雄性SD大鼠，體重在180～200g之間，使用隨機數(shù)字表隨機分為正常對照組(NC組，n=10)和糖尿病組（T2DM組，n=20），正常對照組予普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病

8、組予高脂飼料喂養(yǎng)，第8周末兩組大鼠禁食12 h，糖尿病組大鼠腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，35 mg/kg)2次（間隔7天）進行造模，普通飲食組同時腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。第9周末末次注射STZ72 h后，門靜脈取血測空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)，以胰島素抵抗、空腹血糖≥11.1 mmol/L作為T2DM診斷的標準。
　　將造模成功的大鼠按照隨機數(shù)字表隨機分為模型對照組和利格列汀干預組，利格列汀干預

9、組予利格列汀3mg/kg/d連續(xù)灌胃4周，模型對照組和正常對照組均給予等體積生理鹽水灌胃，繼續(xù)飼養(yǎng)至13周末。觀察各組大鼠食欲、毛發(fā)、大小便、行為及整體狀態(tài)情況，根據(jù)大鼠體質量調整給藥劑量。灌胃藥液均每天配制。末次給藥后，所有大鼠空腹過夜，稱量體質量。以10％水合氯醛腹腔注射進行麻醉，經門靜脈取血，離心取上清，-20℃保存，用于血清學指標的測定;截取近回盲部(＜4cm)的近端結腸組織，于液氮中速凍，然后-80℃保存;
　　全自動生

10、化儀檢測空腹血糖(Fasting Plasma Glucose，F(xiàn)PG)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total Cholesterol，TC);酶聯(lián)免疫吸附試驗(EnzymesLinked Immunosorbent Assay，ELISA)法檢測血漿胰島素(Fasting plasmainsulin，F(xiàn)IN)，計算胰島素敏感指數(shù)（Insulin Sensitivity Index，ISI）、胰島素抵抗指數(shù)(

11、Homeostasis model assessment-insulin resistance index,HOMA-IR)。ISI取自然對數(shù)納入統(tǒng)計分析;利用鱟試劑采用終點顯色法嚴格執(zhí)行無熱原操作檢測血漿LPS含量;ELISA檢測血漿腫瘤壞死因子-α、白介素-6以及二胺氧化酶的含量;免疫印跡法Western blot檢測近端結腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、occludin、胰高血糖素樣肽-2及PAR2的含量。
　　采用SPSS1

12、9.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism6作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差表示，進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，若資料符合正態(tài)性、方差齊，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機設計的方差分析，組間比較采用LSD檢驗;方差不齊時多樣本均數(shù)比較采用近似F檢驗的Welch法;組間比較采用非參數(shù)檢驗的Tamhane's T2法;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、高脂飲食9周聯(lián)合2次鏈脲佐菌素腹腔注射（35 mg/kg，間隔7

13、天）成功制備2型糖尿病大鼠模型
　　第9周末次注射STZ72h后糖尿病組有4只大鼠死亡，剩余16只動物全部存活且空腹血糖均大于11.1 mmol/L，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯降低，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)明顯增高，提示胰島素抵抗明顯，模型制備成功。造模及藥物干預過程中，正常對照組大鼠活動正常，毛發(fā)整齊。模型對照組大鼠活動減少，精神萎靡，多尿且毛發(fā)暗淡凌亂。
　　2、2型糖尿病大鼠腸道緊密連接蛋白表達下調，腸黏膜屏

14、障功能受損
　　第13周末，與正常對照組相比，模型對照組大鼠近端結腸組織緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達降低(p＜0.01);血漿二胺氧化酶的水平明顯升高(p＜0.01，p＜0.05)，提示2型糖尿病大鼠存在腸黏膜屏障功能受損。
　　3、2型糖尿病大鼠血漿LPS及相關炎癥因子水平升高，提示成功誘導“代謝性內毒素血癥”
　　第13周末，與正常對照組相比，模型對照組門靜脈血漿脂多糖(LPS)的水平明顯上升(p＜

15、0.01)，血漿腫瘤壞死因子-α和白介素-6的表達均明顯升高(p＜0.01)。
　　4、DPP-4酶抑制劑利格列汀對2型糖尿病大鼠糖脂水平、胰島素抵抗及體重的影響
　　第13周與正常對照組相比，模型對照組大鼠空腹血糖、空腹血漿胰島素、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血漿甘油三酯及總膽固醇等指標明顯增高(p＜0.01，p＜0.05)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯降低(p＜0.01)，體重也有明顯增加(p＜0.01)
　

16、　經過利格列汀4周的干預，與模型對照組相比，利格列汀干預組大鼠空腹血糖、空腹血漿胰島素、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血漿甘油三酯及總膽固醇等指標水平均顯著降低(p＜0.01)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯升高(p＜0.01)。但對體重無明顯影響(p＞0.05)。
　　5、DPP-4酶抑制劑利格列汀對2型糖尿病大鼠腸黏膜屏障功能和代謝性內毒素血癥的影響
　　經過利格列汀4周的干預，與模型對照組相比，利格列汀干預組大鼠近端

17、結腸組織緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達上升(p＜0.01);血漿二胺氧化酶的水平也有所降低(p＜0.01)。大鼠門靜脈血漿脂多糖(LPS)的水平下降(p＜0.01)，血漿腫瘤壞死因子-α和白介素-6的表達均有明顯降低(p＜0.01)。
　　結論:
　　1、高脂飲食聯(lián)合STZ成功制備了2型糖尿病大鼠模型。
　　2、制備的2型糖尿病大鼠模型腸道緊密連接蛋白表達下降，腸黏膜屏障受損，可以很好的模擬2型糖尿病代謝