低密度脂蛋白介導的自組裝膠束肺腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的:(1)建立紫杉醇含量測定方法;分離人血漿低密度脂蛋白(LDL);(2)合成癸酸接枝的精氨酸改性殼聚糖(ACD)。(3)制備包載紫杉醇(PTX)的聚合物膠束(PTX-ACD)并用LDL對其進行修飾，對兩種載藥膠束進行表征并對其釋放度進行考察。(4)對LDL修飾的載紫杉醇膠束(PTX-LDL-ACD)的體內(nèi)急性毒性，A549細胞移植瘤裸鼠的抗腫瘤活性及體內(nèi)靶向性進行考察，并與紫杉醇注射劑(PTX-INJ)進行比較。(5)評價新型載藥系

2、統(tǒng)PTX-LDL-ADC膠束的體外藥效。對PTX-LDL-ADC的體外細胞毒性、細胞攝取和細胞凋亡進行考察，并與PTX-ADC及原料藥進行比較。
　　方法:(1)采用高效液相色譜法建立紫杉醇的含量測定方法;溴化鉀密度梯度離心法從人血漿中分離LDL并對其進行表征;(2)分別用IR、1H NMR、廣角x射線衍射(WAXD)和差示掃描量熱法(DSC)等技術對殼聚糖衍生物結構進行表征，并考察其在各種溶劑中的溶解性能及其對難溶性藥物的增溶能

3、力。(3)初步篩選載藥膠束的制備方法，并對其制備工藝進行優(yōu)化;采用EDC·HCl和NHS活化法將LDL接枝于膠束上;對其進行表征;透析袋法測定兩種載藥膠束的釋放度。(4)利用小鼠急性毒性實驗測定LD50。建立動物腫瘤模型，繪制在體腫瘤生長曲線，計算各組裸鼠的抑瘤率。HE染色后進行病理組織學觀察。構建了具備靶向性的Cy7-LDL-ACD，并對其體內(nèi)靶向性進行研究。(5) MTT法求算腫瘤細胞抑制率IR。分別利用共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡觀察

4、膠束在A549細胞內(nèi)的攝取和分布情況。利用熒光顯微鏡考察不同膠束誘導癌細胞凋亡的情況。
　　結果:(1)建立了PTX的HPLC標準曲線，其回歸方程為y=33.784x+6.073，R2=0.99996，PTX濃度在0.5～200μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。分離得到的LDL平均粒徑為(28.7±5.1)nm，PDI為0.208，透射電鏡下觀察LDL的形態(tài)為圓整球狀;應用Bradford法測得LDL蛋白濃度（未經(jīng)濃縮）為0.808

5、mg·mL-1。(2)所制得的兩親性嵌段共聚物精氨酸-殼聚糖-癸酸(ACD)的分子量約為8.3kD，熒光光譜法測得ACD臨界膠束濃度約為3.299×10-2mg·mL-1;溶解度實驗表明其在pH1～12溶液中均可溶解，并可在水中自組裝形成帶有淡藍色乳光的膠束溶液;(3)選取超聲法為本實驗載藥膠束的制備方法并對其進行優(yōu)化，得到最佳制備工藝為:ACD的濃度3 mg·mL-1、藥載比3∶10、超聲次數(shù)200次。紅外和凝膠電泳試驗表明LDL成功

6、接上載藥膠束;其釋放符合Higuchi方程，遵循骨架型釋放模型特點。馬爾文粒徑測定儀顯示系列ARG-CS-DA形成的聚合物膠束平均粒徑為166.3 nm，多分散系數(shù)為0.2，Zeta電位為+21.75～+29.80 mV。(4) PTX-ACD及PTX-LDL-ACD組小鼠尾靜脈注射的LD50及其95％可信限，分別為65.36(40.92～94.70) mg·kg-1和70.81(44.33～102.59) mg·kg-1。PTX-LD

7、L-ACD組小鼠尾靜脈注射的LD50為PTX-INJ組的2.4倍，PTX-ACD組小鼠尾靜脈注射的LD50為PTX-INJ組的2.2倍。腫瘤抑制強弱順序為:PTX-LDL-ACD＞PTX-ACD＞PTX-INJ，其中PTX-LDL-ACD抑瘤率達到63.42％。尾靜脈給藥1h后，2種膠束在體內(nèi)均可全身彌散，6h內(nèi)腫瘤部位可見較為集中的熒光分布;在12h內(nèi)，可較為明顯的觀察到膠束在裸鼠肝臟與腫瘤部位集中;72h內(nèi)PTX-LDL-ACD組裸

8、鼠腫瘤部位仍可觀察到較強的熒光。(5)載藥膠束的細胞毒性PTX-LDL-ADC＞PTX-ADC＞PTX;細胞攝取PTX-LDL-ADC＞PTX-ADC;對細胞凋亡的影響PTX-LDL-ADC＞PTX-ADC＞PTX。
　　結論:成功建立了紫杉醇的HPLC含量測定方法;分離得到純度較高的LDL;制備了PTX-ACD載藥膠束，并將LDL成功連接到膠束上。PTX載藥膠束具有增加藥物溶解性、減緩藥物釋放的作用。急性毒性實驗表明，PTX-A