miR-20b對(duì)Th17細(xì)胞分化和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、Th17細(xì)胞作為第三類(lèi)效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞，在多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis，MS)中發(fā)揮重要的致病作用。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)是一種針對(duì)人類(lèi)MS建立的被廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型。EAE是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)炎癥，組織學(xué)表現(xiàn)為中樞神經(jīng)脫髓鞘及炎癥性Th1和Th2細(xì)胞浸潤(rùn)。miRNA是一類(lèi)小的非轉(zhuǎn)錄RNA，通常通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

2、影響靶基因表達(dá)。目前，大量研究表明miRNAs在Th17細(xì)胞誘導(dǎo)的自身免疫疾病方面發(fā)揮重要作用，例如人類(lèi)的MS。有研究顯示miR-20b在MS臨床病人的外周血細(xì)胞中低表達(dá)，但是miR-20b在Th17細(xì)胞分化及EAE中的調(diào)控作用未見(jiàn)報(bào)道。
　　我們首先建立了EAE，作為探討miR-20b對(duì)于MS致病作用影響的動(dòng)物模型。我們發(fā)現(xiàn)miR-20b在來(lái)自于EAE小鼠的CD4+T細(xì)胞中顯著低表達(dá)。此外，通過(guò)將na(i)ve CD4+T細(xì)胞在

3、體外以natural、Th1、Th2、Th17、Treg不同方向分化而檢測(cè)其中miR-20b的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于natural CD4+T細(xì)胞，miR-20b在Th17細(xì)胞中顯著低表達(dá)，而在Th1、Th2和iTreg細(xì)胞中則變現(xiàn)為表達(dá)上升。基于上述結(jié)果，我們推測(cè)miR-20b可能通過(guò)影響Th17分化而在EAE的發(fā)病過(guò)程中參與調(diào)控。因?yàn)閙iRNAs主要通過(guò)其靶基因發(fā)揮調(diào)控作用，因此我們繼續(xù)尋找與Th17細(xì)胞分化相關(guān)的miR-20b可能的

4、靶基因。
　　我們利用小鼠TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)miR-20b的備選靶基因。通過(guò)熒光素酶檢測(cè)、GFP抑制實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，我們鑒定并確定RORγt和STAT3為miR-20b可能的靶基因。我們還發(fā)現(xiàn)miR-20b分別在mRNA水平抑制STAT3基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制RORγt基因表達(dá)兩種不同機(jī)制發(fā)揮其調(diào)控作用。
　　考慮到RORγt和STAT3作為T(mén)h17細(xì)胞分化的主要調(diào)控基因，我們推測(cè)miR-20b可能直接

5、參與Th17細(xì)胞分化的調(diào)控。在Th17細(xì)胞體外分化過(guò)程中，通過(guò)分別轉(zhuǎn)染miR-20b的陰性對(duì)照(NC)、抑制序列(inhibitor)及模擬序列(mimics)，我們發(fā)現(xiàn)mimics轉(zhuǎn)染組IL-17A表達(dá)顯著下調(diào)，而inhibitor轉(zhuǎn)染組IL-17A表達(dá)輕微上調(diào)。相同的，三組IL-17F表達(dá)與IL-17A表達(dá)類(lèi)似。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)在三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，IL-17A和IL-17F的表達(dá)也可以被miR-20b的mimics顯著下調(diào)

6、。我們進(jìn)一步將miR-20b NC、inhibitor及mimics用FAM熒光標(biāo)記，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞中Th17細(xì)胞相關(guān)IL-17A和IL-17F的表達(dá)，結(jié)果與上面類(lèi)似。上述結(jié)果證明miR-20b可以在體外負(fù)向調(diào)控Th17細(xì)胞的分化。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的預(yù)測(cè)，即miR-20b可能在體內(nèi)調(diào)控EAE的發(fā)病進(jìn)程，我們構(gòu)建了pri-miR-20b慢病毒表達(dá)載體。小鼠尾靜脈分別注射表達(dá)pri-miR-20b(LV-miR-20b)及

7、陰性對(duì)照(LV-NC)的慢病毒，7天后，誘導(dǎo)EAE發(fā)病，結(jié)果顯示LV-miR-20b感染組小鼠發(fā)病分值統(tǒng)計(jì)顯著減輕。腰髓切片組織學(xué)分析顯示LV-miR-20b感染組的小鼠炎癥浸潤(rùn)及脫髓鞘情況也顯著緩解。此外，小鼠免疫后14天尾靜脈注射上面兩種慢病毒，結(jié)果顯示LV-miR-20b感染組的小鼠疾病嚴(yán)重程度亦有所下降，這些結(jié)果提示miR-20b能夠抑制EAE的發(fā)病進(jìn)程。
　　為繼續(xù)深入探討miR-20b是否能夠在EAE發(fā)病過(guò)程中對(duì)于Th

8、17細(xì)胞的產(chǎn)生有所影響。我們收集LV-miR-20b及LV-NC感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單核細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在LV-miR-20b感染組小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，進(jìn)一步胞內(nèi)細(xì)胞因子分析結(jié)果顯示Th17細(xì)胞比例也顯著降低。在LV-miR-20b感染組小鼠的引流淋巴結(jié)中，我們也發(fā)現(xiàn)更少的Th17細(xì)胞浸潤(rùn)，此外，將這些淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)并用誘導(dǎo)EAE發(fā)病的MOG35-55再刺激,LV-miR-20b感染組的細(xì)胞培養(yǎng)上清

9、中IL-17A的表達(dá)也相應(yīng)減少。上述結(jié)果表明miR-20b在EAE發(fā)病過(guò)程中可以在體內(nèi)抑制Th17細(xì)胞的產(chǎn)生。
　　最后，我們發(fā)現(xiàn)EAE發(fā)病小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞的RORγt和STAT3蛋白表達(dá)較正常小鼠顯著上升。此外，在都誘導(dǎo)小鼠EAE發(fā)病的前體下，相對(duì)于LV-NC感染組，LV-miR-20b感染組小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞的RORγt和STAT3蛋白表達(dá)顯著被下調(diào)。我們進(jìn)一步證明miR-20b在體內(nèi)可能通過(guò)靶向調(diào)控RORγt和