水稻端粒酶RNA鑒定體系優(yōu)化及候選序列確認(rèn).pdf

1、端粒是真核生物體內(nèi)由端粒DNA和其結(jié)合蛋白所構(gòu)成的復(fù)合體，能保護(hù)染色體末端，使之與普通的染色體有所區(qū)分，而不被各種酶降解，防止末端融合。端粒酶則是生物體內(nèi)負(fù)責(zé)合成端粒的一種生物酶，由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶亞基(TERT)和端粒酶RNA亞基(TER)構(gòu)成。端粒酶的TERT亞基利用其TER亞基作為模板連續(xù)復(fù)制出端粒DNA，從而補(bǔ)償在染色體復(fù)制過(guò)程中的末端隱縮，保證染色體的復(fù)制和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
　　據(jù)報(bào)道端粒酶RNA已經(jīng)從原生動(dòng)物、酵母和人類中得到

2、了克隆，也證實(shí)了TER成分在維持端粒酶功能方面具有重要作用，但其長(zhǎng)度和序列在這些物種之間沒(méi)有相似性。說(shuō)明TER中除端粒模板序列保守外，其余區(qū)域的保守性極低，很難基于同源序列實(shí)施克隆。目前，植物中也僅報(bào)道了擬南芥TER的克隆。我們先后多次嘗試了基于擬南芥TER序列對(duì)水稻的TER實(shí)施克隆，但均告失敗。
　　本研究的目的在于優(yōu)化一套已建立的水稻端粒酶RNA鑒定體系，并鑒定一條實(shí)驗(yàn)室獲得的具水稻TER特征的候選序列。該序列已與報(bào)道過(guò)的擬南

3、芥TER的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)行了對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)兩者具有類似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及相關(guān)特征。本實(shí)驗(yàn)選用中花11號(hào)水稻的成熟胚為材料誘導(dǎo)出愈傷組織，通過(guò)多重PCR方法對(duì)候選序列的模板區(qū)進(jìn)行單堿基T/A突變（5'-AAACCCTAA-3'），將擴(kuò)增得到的未突變型和突變型序列分別裝載到pMD18-T載體中進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的序列裝載于pCambial1301載體，從而構(gòu)建出未突變型和突變型兩種穿梭載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將兩種序列分別導(dǎo)入愈傷組織中。提

4、取抗性愈傷組織的基因組和端粒酶蛋白，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因愈傷組織后，進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)基因植株的誘導(dǎo)培養(yǎng)。
　　對(duì)水稻愈傷組織進(jìn)行端粒酶活性的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在缺乏dATP的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法反應(yīng)中，突變型愈傷組織的端粒酶活性明顯高于未突變型。并對(duì)體外端粒延伸的ssDNA進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果所測(cè)片段均含有突變特征序列，符合水稻端粒末端重復(fù)序列的特征;再對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了端粒的鑒定，結(jié)果所測(cè)7個(gè)端粒序列中，有2個(gè)含有突變特征序列。