臨床常用移植保存介質(zhì)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性與體內(nèi)治療效果的影響及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、背景:
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一類具有自我更新、多向分化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)特性的多能干細(xì)胞，為利用傳統(tǒng)療法治療效果不佳的難治性肺部疾?。ㄈ缏宰枞苑渭膊　⒅夤芟?、急性肺損傷、肺動(dòng)脈高壓等）提供了新的治療思路與手段。傳統(tǒng)MSCs來源于骨髓，骨髓源MSCs在骨髓中含量極少(＜0.01％)，且隨年齡的增長增殖與分化能力減弱，并不能滿足臨床需要。因而，細(xì)胞需要量與供應(yīng)量間的矛

2、盾成為制約MSCs臨床應(yīng)用的首要問題。臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，UC-MSCs)憑借來源廣泛、含量豐富、獲取容易、不涉及倫理等優(yōu)勢為這一矛盾的解決帶來了新的希望，但傳統(tǒng)制備工藝獲取UC-MSCs.效率偏低，遠(yuǎn)不能達(dá)到臍帶中所含UC-MSCs的理論值，造成一定程度上生物資源的浪費(fèi)。對(duì)現(xiàn)行的傳統(tǒng)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，不僅有效節(jié)約資源，為UC-MSCs規(guī)模化生產(chǎn)提供可能，也為日益增

3、長的臨床需求提供保障。
　　 MSCs治療已在肺部疾病的研究中廣泛開展，但MSCs在臨床應(yīng)用前尚有許多問題需要解決。在MSCs移植治療中一直存在著一個(gè)突出的臨床困惑，即應(yīng)用同一實(shí)驗(yàn)室相同細(xì)胞源與細(xì)胞數(shù)量的MSCs進(jìn)行移植時(shí)，不同的臨床前處理過程所獲得的治療效果差異很大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道與我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)結(jié)束后到臨床使用前MSCs的制備過程、儲(chǔ)存條件等與治療效果有著密切的關(guān)系。移植用的MSCs從實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)到臨床輸注，需要經(jīng)過標(biāo)

4、本采集、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞傳代、細(xì)胞消化、細(xì)胞保存、細(xì)胞運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)環(huán)節(jié)，以上各個(gè)環(huán)節(jié)均可能會(huì)影響MSCs移植前細(xì)胞質(zhì)量。在眾多問題中，移植保存條件（包括移植保存介質(zhì)、保存時(shí)間與保存溫度）對(duì)細(xì)胞質(zhì)量的影響最為直接與關(guān)鍵，但目前并無相關(guān)指南及系統(tǒng)研究。
　　 雖然MSCs細(xì)胞進(jìn)行治療時(shí)，新鮮分離的MSCs即刻進(jìn)行移植可獲得最大的移植效果。但事實(shí)上，MSCs在臨床應(yīng)用時(shí)并不能實(shí)現(xiàn)即刻輸注，運(yùn)輸、手術(shù)等待等因素均需要將MSCs在美國食品藥物

5、管理局(FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的，可被直接輸注于人體的移植介質(zhì)中保存一定時(shí)間，但目前尚無關(guān)于MSCs移植保存介質(zhì)的相關(guān)推薦。各個(gè)研究組通常采用O.9％氯化鈉注射液、5％葡萄糖注射液、勃脈力A、1％人血白蛋白溶液與5％人血白蛋白溶液作為MSCs移植時(shí)的移植保存介質(zhì)，但關(guān)于這些移植保存介質(zhì)對(duì)保存后MSCs生物學(xué)特性的影響并無相關(guān)報(bào)道。而需特別注意的是，上述臨床常用的移植保存介質(zhì)相對(duì)于MSCs正常生長

6、環(huán)境而言，缺乏必要的生存條件及營養(yǎng)成分，這很可能引起MSCs在保存過程中活性的下降，進(jìn)而影響MSCs治療效果。這一點(diǎn)雖應(yīng)在MSCs移植時(shí)引起高度注意，卻在臨床應(yīng)用時(shí)常常被忽略。因此，評(píng)價(jià)現(xiàn)行移植保存介質(zhì)對(duì)MSCs生物學(xué)特性及臨床治療效果的影響十分必要。
　　 因此，本研究綜合以上兩個(gè)MSCs臨床應(yīng)用前的關(guān)鍵問題，首先對(duì)UC-MSCs傳統(tǒng)分離工藝進(jìn)行改良，旨在建立一種高效、快速獲取UC-MSCs的方法，為生物資源的有效利用及UC-

7、MSCs規(guī)?；a(chǎn)提供可能。再以UC-MSCs為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)現(xiàn)行移植保存介質(zhì)對(duì)細(xì)胞保存過程中體外生物學(xué)特性及體內(nèi)治療效果的影響。在體內(nèi)治療效果評(píng)價(jià)模型選擇方面，我們選擇了造模時(shí)間短且對(duì)MSCs治療效果較為肯定的急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)作為研究對(duì)象。由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示目前常用的移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs短期保存即可引起細(xì)胞活性的快速下降，不能滿足FDA關(guān)于細(xì)胞移植的最低活性要求。因此，我們對(duì)目前臨床常用移植保

8、存介質(zhì)引起UC-MSCs活性下降的機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期一方面可以通過簡單改造提高現(xiàn)行移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs的保存效果，另一方面為最適移植保存介質(zhì)的配制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.根據(jù)臍帶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇相應(yīng)消化酶，對(duì)UC-MSCs分離制各工藝進(jìn)行優(yōu)化，探尋一套高效、快速、大量獲取UC-MSCs的分離方法;
　　 2.評(píng)價(jià)現(xiàn)行移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs體外生物學(xué)特性的影響;
　　 3.建

9、立急性肺損傷模型，觀察UC-MSCs對(duì)其治療作用，同時(shí)評(píng)價(jià)現(xiàn)行移植保存介質(zhì)引起的活性細(xì)胞數(shù)量下降對(duì)UC-MSCs體內(nèi)治療效果的影響;
　　 4.探討氧化應(yīng)激在UC-MSCs保存過程中對(duì)其保存效果的影響;
　　 5.探討能量缺乏在UC-MSCs保存過程中對(duì)其保存效果的影響。
　　 方法:
　　 1.UC-MSCs分離制備工藝的優(yōu)化及UC-MSCs的培養(yǎng)與鑒定
　　 根據(jù)臍帶中束縛UC-MSCs的基質(zhì)

10、成分，選擇膠原酶Ⅰ、Ⅲ及透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、DNA酶作為改良消化液組分，對(duì)改良酶消化法與傳統(tǒng)酶消化法（膠原酶Ⅱ與胰蛋白酶）在不同時(shí)間收獲的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活性、原代貼壁細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間、首次傳代時(shí)間方面進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)兩種方法所獲得的第三代細(xì)胞在增殖能力、表面標(biāo)記、多向分化潛能方面進(jìn)行鑒定。
　　 2.現(xiàn)行移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs體外生物學(xué)特性影響的研究
　　 將脫離正常培養(yǎng)環(huán)境的UC-MSCs重懸保存于臨床常用的移植保

11、存介質(zhì)O.9％氯化鈉注射液,5％葡萄糖注射液，勃脈力A，1％人血白蛋白溶液和5％人血白蛋白溶液中，在4℃或24℃（室溫）條件下保存2,4，6h，觀察上述移植保存條件對(duì)保存后UC-MSCs細(xì)胞活性、凋亡/死亡率、保存后細(xì)胞增殖能力、表面標(biāo)記、免疫調(diào)節(jié)能力、多向分化潛能及DNA損傷的影響。
　　 3.移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs體內(nèi)治療效果影響的研究
　　 ALI是呼吸系統(tǒng)疾病危重癥之一，MSCs在ALI中治療效果較為肯定，

12、造模容易且周期較短。為了評(píng)價(jià)臨床常用移植保存介質(zhì)引起活性細(xì)胞數(shù)量下降對(duì)體內(nèi)效果的影響，我們選擇ALI模型作為觀察對(duì)象。在這部分研究中，我們將大鼠隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組、ALI組與UC-MSCs移植組。ALI組和UC-MSCs移植組采用經(jīng)氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素建立急性肺損傷模型。成功造模1h后，UC-MSCs移植組經(jīng)尾靜脈輸注不同存活細(xì)胞數(shù)量的UC-MSCs懸液，正常對(duì)照組和急性肺損傷組同法予以等量生理鹽水。各組在UC-MSCs及生理鹽水輸注

13、后24和72h，觀察肺組織病理改變，檢測病理組織評(píng)分、干濕重比、肺組織髓過氧化物酶活性及血漿IL-6、IL-1O、TNF-α水平。
　　 4.UC-MSCs保存過程中氧化應(yīng)激水平變化的觀察
　　 現(xiàn)行移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs在4℃與24℃條件下保存2,4，6h后測定細(xì)胞內(nèi)活性氧及細(xì)胞裂解液丙二醛含量，評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激水平。在各種現(xiàn)行移植保存介質(zhì)中添加不同濃度自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，

14、NAC)觀察其對(duì)UC-MSCs活性的影響，從而篩選出最佳添加濃度。此外，進(jìn)一步觀察添加NAC后的各種移植保存介質(zhì)對(duì)保存效果的改善情況。
　　 5.UC-MSCs保存過程中能量缺乏對(duì)其保存效果作用的研究
　　 現(xiàn)行移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs在4℃與24℃條件下保存2,4，6h后測定細(xì)胞內(nèi)ATP水平及上清乳酸脫氫酶釋放量，評(píng)價(jià)能量缺乏情況。在各種現(xiàn)行移植保存介質(zhì)中添加腺苷觀察其對(duì)UC-MSCs保存效果的影響。另外，利用腺苷

15、廣譜受體拮抗劑與轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑進(jìn)一步評(píng)價(jià)腺苷發(fā)揮作用的途徑。
　　 結(jié)果:
　　 1.改良酶消化法較傳統(tǒng)酶消化法相比，臍帶消化后所獲得的總細(xì)胞量從2.58±0.32x105/g提高至1.78±1.06x106/g;原代貼壁細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間從24h縮短至12h;首次傳代時(shí)間從9.5±1.1天縮短至5.8±1.2天;改良酶消化法所獲得的P3代UC-MSCs在增殖能力、表面標(biāo)記及多向分化能力方面與傳統(tǒng)酶消化法相似，符合MSCs鑒定標(biāo)

16、準(zhǔn)。
　　 2.UC-MSCs保存于各種移植保存介質(zhì)中，細(xì)胞活性與貼壁能力隨時(shí)間延長而明顯下降。經(jīng)上述移植保存介質(zhì)保存6h，UC-MSCs活性降至83～53％，細(xì)胞貼壁率降至72％～38％。并且，經(jīng)過上述保存介質(zhì)保存后的UC-MSCs不同程度的出現(xiàn)了DNA損傷。仍可貼壁的細(xì)胞增殖能力、表面標(biāo)記、免疫調(diào)節(jié)及多向分化能力未受明顯影響，仍可貼壁細(xì)胞未見明顯DNA損傷。
　　 3.UC-MSCs對(duì)ALI有明顯的治療效果。與損傷組

17、相比，UC-MSCs治療組可改善肺組織損傷程度、降低損傷評(píng)分、肺組織干濕重比及血漿IL-6和TNF-α水平及升高血漿lL-1O水平。不同存活細(xì)胞數(shù)量的UC-MSCs與UC-MSCs治療組相比，病理觀察肺組織損傷程度差別不明顯，病理損傷評(píng)分、干濕重比無顯著差別，肺組織髓過氧化物酶活性、血漿IL-6、IL-10和TNF-α水平均差別顯著。
　　 4.UC-MSCs在所評(píng)價(jià)的各種移植保存介質(zhì)中保存，細(xì)胞內(nèi)活性氧均在保存2h達(dá)到最高峰。

18、細(xì)胞裂解液丙二醛含量呈時(shí)間依賴性增加。不同濃度NAC對(duì)UC-MSCs活性的影響呈鐘形曲線。5mMNAC為現(xiàn)行移植保存介質(zhì)中最適的添加濃度，添加后可將UC-MSCs貼壁率提高8％～1O％。UC-MSCs多向分化能力未受明顯影響。
　　 5.UC-MSCs在所評(píng)價(jià)的各種移植保存介質(zhì)中保存，細(xì)胞內(nèi)ATP水平呈時(shí)間依賴性下降。添加1mM腺苷可維持UC-MSCs在保存過程中細(xì)胞內(nèi)ATP水平的穩(wěn)定，減緩細(xì)胞活性下降速度。此外，腺苷在保存過程

19、中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用是通過直接升高細(xì)胞內(nèi)ATP水平而非受體途徑來實(shí)現(xiàn)的。添加腺苷后未明顯影響UC-MSCs分化能力。
　　 結(jié)論:
　　 1.改良后的酶消化法可明顯提高UC-MSCs產(chǎn)量，縮短培養(yǎng)時(shí)間，所培養(yǎng)UC-MSCs符合鑒定標(biāo)準(zhǔn);
　　 2.現(xiàn)行的臨床常用移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs保存6h即引起存活細(xì)胞數(shù)量的明顯下降且保存后UC-MSCs出現(xiàn)不同程度的DNA損傷。這一點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中，應(yīng)引起特別關(guān)注。貼壁能

20、力測定較其他檢測指標(biāo)簡單、敏感、可靠，可較好評(píng)價(jià)保存效果;
　　 3.存活細(xì)胞數(shù)量的不同影響ALI體內(nèi)治療效果，主要表現(xiàn)在對(duì)ALI體內(nèi)炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)的平衡調(diào)節(jié)能力下降，而炎癥介質(zhì)失衡可能影響預(yù)后;
　　 4.臨床常用移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs保存過程中明顯增高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，降低氧化應(yīng)激水平可一定程度上提高保存過程中活性細(xì)胞數(shù)量;
　　 5.臨床常用移植保存介質(zhì)對(duì)UC-MSCs保存過程中明顯降低細(xì)胞內(nèi)AT