HnRNP A2-B1在NSCLC中的表達(dá)及其在NSCLC發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、肺癌的發(fā)病率和死亡率目前已經(jīng)排在各種惡性腫瘤的第一位,但其發(fā)病機(jī)制尚未闡明,且缺乏早期診斷指標(biāo)。核不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1,hnRNPA2/B1)是一種重要的RNA結(jié)合蛋白,主要負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前已知DNA修復(fù)酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanineDNA-methyltransferase,MGMT).8-羥基鳥

2、嘌呤DNA糖苷酶(8-oxoguanineDNAglycosylase,OGGl).氧化/還原因子-1(redoxfactor1,ref-1).2種DNA依賴性蛋白激酶(DNA-dependentproteinkinase,DNA-PK)—DNA-PKcs和ku在肺癌組織中的表達(dá)與正常肺組織有明顯差別,均與肺癌的發(fā)生相關(guān)?；谝陨媳尘?本研究目的旨在觀察hnRNPA2/B1蛋白及mRNA在非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllung

3、cancer,NSCLC)癌組織及對應(yīng)正常肺組織中的表達(dá)情況;檢測hnRNPA2/B1蛋白與DNA修復(fù)酶MGMT、OGG1、ref-1、DNA-PKcs和Ku的mRNA是否結(jié)合,初步探討其對5種DNA修復(fù)酶是否存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,試圖揭示其在NSCLC發(fā)病機(jī)制中的作用;并探討痰中檢測hnRNPA2/B1在肺癌早期診斷中的意義以及胸水檢測hnRNPA2/B1對于鑒別肺腺癌細(xì)胞與間皮細(xì)胞的價(jià)值。方法分別從蛋白水平及mRNA水平檢測hnRNP

4、A2/B1在NSCLC中的表達(dá)情況:采用免疫組織化學(xué)方法檢測50例、WesternBlot方法檢測10例及熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)方法檢測22例NSCLC患者癌組織及對應(yīng)正常肺組織中hnRNPA2/B1的表達(dá)情況;采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-IP)結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法研究人肺鱗癌細(xì)胞株(HTB-182)中hnRNPA2/B1蛋白是否與5種DNA修復(fù)酶的

5、mRNA目結(jié)合,之后采用免疫組織化學(xué)方法檢測50例(標(biāo)本同檢測hnRNPA2/B1所用標(biāo)本)及real-timePCR方法檢測22例NSCLC(標(biāo)本同檢測hnRNPA2/B1所用標(biāo)本)患者癌組織及對應(yīng)正常肺組織中MGMT的表達(dá)情況。另收集63例疑診肺癌患者的痰標(biāo)本,分別采用痰涂片及細(xì)胞塊切片細(xì)胞學(xué)檢查(鏡檢找到癌細(xì)胞即診斷為肺癌)和痰細(xì)胞塊切片免疫組織化學(xué)檢測hnRNPA2/B1(表達(dá)陽性即診斷為肺癌)的方法進(jìn)行診斷,比較兩種診斷方法的

6、結(jié)果。采用細(xì)胞塊技術(shù)結(jié)合免疫組織化學(xué)方法檢測100例胸水標(biāo)本中hnRNPA2/B1的表達(dá)情況,觀察其表達(dá)在肺腺癌細(xì)胞和間皮細(xì)胞中的差異。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理,以p＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果HnRNPA2/B1蛋白及mRNA在NSCLC癌組織中的表達(dá)較對應(yīng)正常肺組織升高:免疫組織化學(xué)顯示hnRNPA2/B1定位于細(xì)胞核,其在NSCLC癌組織中的陽性率及評分(100％,5.3±0.9)均顯著高于正常肺組織(3

7、2%,2.2±0.7)(p＜0.01),在Ⅲ-Ⅳ期NSCLC癌組織中的表達(dá)略高于Ⅰ-Ⅱ期,在NSCLC癌組織中的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤類型及吸煙史無明顯相關(guān)性(p＞0.05);WesternBlot檢測結(jié)果顯示hnRNPA2/B1在NSCLC癌組織中的平均灰度比值(1.4±0.5)明顯高于正常肺組織(0.7±0.2)(p＜0.01);real-timePCR檢測結(jié)果顯示hnRNPA2/B1mRNA在NSCLC癌組織中的平均表達(dá)量37.4

8、(15.6～82.6)明顯高于正常肺組織17.6(7.8～27.8)(p＜0.01)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)先將人肺鱗癌細(xì)胞株(HTB-182)中的hnRNPA2/B1蛋白與hnRNPA2/B1單抗的抗原抗體復(fù)合物沉淀,之后RT-PCR檢測從免疫共沉淀產(chǎn)物中擴(kuò)增出MGMTmRNA,提示hnRNPA2/B1蛋白與MGMTmRNA相結(jié)合,之后的免疫組織化學(xué)和real-timePCR檢測揭示MGMT蛋白及mRNA在NSCLC癌組織中的表達(dá)均較對應(yīng)正常

9、肺組織減低:免疫組織化學(xué)顯示MGMT定位于細(xì)胞核,其在NSCLC癌組織中的陽性率及評分(32%,2.2±0.8)均明顯低于正常肺組織(78%,4.1±1.2)(p＜0.01);對hnRNPA2/B1與MGMT在NSCLC癌組織中的表達(dá)評分作相關(guān)性分析,得出兩者存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(F=-0.49,p＜0.01);real-timePCR檢測結(jié)果顯示MGMT在NSCLC癌組織中的平均表達(dá)量1.8(0.6～3.1)明顯低于正常肺組織9.8(6.8

10、～18.3)(p＜0.01)。痰涂片及細(xì)胞塊切片細(xì)胞學(xué)檢查診斷肺癌的敏感度為31.8%,特異度為100%。痰細(xì)胞塊檢測hnRNPA2/B1診斷肺癌的敏感度為80%,特異度為68.4%。痰檢hnRNPA2/B1的敏感度明顯高于痰細(xì)胞學(xué)檢查(p＜0.01)。HnRNPA2/B1在胸水肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)陽性率為100%(60/60),在間皮細(xì)胞中陽性率為30%(12/40),兩組間存在顯著差異(p＜0.01)。HnRNPA2/B1標(biāo)記胸水肺腺

11、癌細(xì)胞的敏感度為100%,特異度為70%。結(jié)論1.本研究通過免疫組織化學(xué)檢測、WesternBlot檢測及熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測揭示hnRNPA2/B1蛋白及mRNA在NSCLC癌組織中的表達(dá)均較對應(yīng)正常肺組織升高,且免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示病變越晚期hnRNPA2/B1表達(dá)越高,提示它可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān),而hnRNPA2/B1在NSCLC癌組織中的表達(dá)與年齡、性別、組織學(xué)類型及吸煙史無明顯相關(guān)性。2.本研究通過免疫共沉淀結(jié)合R

12、T-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)hnRNPA2/B1蛋白與MGMTmRNA相結(jié)合,提示hnRNPA2/B1可能對MGMTmRNA存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。之后的免疫組織化學(xué)檢測及熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測表明MGMT蛋白及mRNA在NSCLC癌組織中的表達(dá)均較正常肺組織減低,推測hnRNPA2/B1可能通過對MGMTmRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,下調(diào)MGMT蛋白表達(dá),削弱細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力,從而參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生。3.痰細(xì)胞塊結(jié)合免疫組織化學(xué)法檢測hnRNPA2