副豬嗜血桿菌喹諾酮耐藥分子特征及豬鏈球菌多重耐藥機制研究.pdf

1、細菌耐藥性是細菌抵抗藥物殺傷或抑制作用的一種表型，是制約臨床細菌疾病預防和治療的一個重要因素。隨著抗菌藥物的研究與發(fā)展，其臨床應用也越來越廣泛，甚至一些濫用現(xiàn)象也開始頻繁出現(xiàn)，這都為細菌耐藥性的出現(xiàn)提供了有利條件。近年來，細菌的耐藥性問題越來越嚴峻(Aarestrup2005)，細菌的耐藥性正在朝著高耐藥率，多重耐藥的方向發(fā)展，已經(jīng)成為了一個嚴重的人類公共衛(wèi)生問題。副豬嗜血桿菌(HPS)和豬鏈球菌(SS)作為全球性的重要的豬傳染病病原，

2、近年來隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，其耐藥情況也越來越嚴重，本論文對其耐藥機制分別進行了研究，主要的成果如下:
　　1、副豬嗜血桿菌臨床分離菌株喹諾酮耐藥分子機制研究
　　本研究中，以138株HPS臨床分離菌株為研究對象，首先利用E-test藥敏紙條分別檢測每株細菌對恩諾沙星和左旋氧氟沙星的MIC值，根據(jù)2008年頒布的CLSI標準，判定138株HPS的耐藥情況分別為:恩諾沙星的耐藥率為60.1％，左旋氧氟沙星的耐藥率為5.8％，并

3、且左旋氧氟沙星的耐藥菌株對恩諾沙星均表現(xiàn)出了高水平的耐藥性。進一步，通過測序分析喹諾酮耐藥相關基因DNA解旋酶(GyrA、GyrB)和拓撲異構酶Ⅳ(ParC、ParE)的突變情況，結(jié)合各菌株的耐藥性，共發(fā)現(xiàn)了10個耐藥相關基因突變位點。其中，GyrA87位點在所有恩諾沙星耐藥菌株中的突變率為100％，提示了GyrA87位點的突變對HPS喹諾酮耐藥性形成的重要性;進一步分析發(fā)現(xiàn)ParC73位點的突變，能夠協(xié)助其它相關突變位點增強HPS對喹

4、諾酮藥物的耐受性;甚至，本研究中還首次發(fā)現(xiàn)了ParE的耐藥相關突變位點（ParE551位點的突變）。為了更加直接的證明DNA解旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的突變是引起HPS耐受恩諾沙星和左旋氧氟沙星的原因，本研究中，進行了定向點突變實驗，分別為:GyrA(87D→N)、 ParC(73S→R)、ParE(551T→A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個位點的突變均能使細菌對恩諾沙星和左旋氧氟沙星的MIC值明顯升高，證明了DNA解旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的突變確實是引起細

5、菌耐受喹諾酮的重要原因。另外，本研究中繼續(xù)分析了HPS的假設毒力因子與其喹諾酮耐藥性之間的相關性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS的喹諾酮耐藥菌株較其敏感菌株，含有更多的假設毒力因子（hh dA、fimB和hsdR），表明在HPS中，喹諾酮耐藥性與其假設毒力因子之間存在正相關性，這一結(jié)果不同于以往的任何相關報道，這為該方面的研究提供了新的視野，使其更加全面和豐富。
　　2、豬鏈球菌R61多重耐藥機制的研究
　　R61是本實驗室前期工作中發(fā)現(xiàn)的

6、一株“超級耐藥”豬鏈球菌，雖然通過比較基因組學分析部分解釋了其耐藥機制，但是卻并不完善，因此，本研究以R61為研究對象，繼續(xù)對其多重耐藥機制展開了研究。首先，將R61在不同條件下培養(yǎng)（分別添加阿莫西林、氯霉素、頭孢噻肟、紅霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素，無抗生素添加，以及同時添加上述6種抗生素），待其生長至對數(shù)中期時，分別提取其全菌蛋白。然后進一步通過雙向電泳分析藥物刺激后R61的差異表達蛋白，共46個（大于2倍），其中上調(diào)表達蛋白32個，下

7、調(diào)表達蛋白14個，并分別對這些差異蛋白進行質(zhì)譜鑒定。為了進一步探索R61的耐藥機制，結(jié)合各蛋白的功能及特點，選取可能與耐藥性相關的13個蛋白（上調(diào)9個，下調(diào)4個），分別構建其過表達菌株（上調(diào)蛋白構建A7過表達菌株，下調(diào)蛋白構建R61過表達菌株）并檢測其MIC值的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):SSUR61_0413（β-內(nèi)酰胺水解酶）和SSUR61_2137（新陳代謝控制蛋白A）基因的上調(diào)，以及SSUR61_1509（自溶素）的下調(diào)，均能夠使細菌對