超聲聲孔效應(yīng)增敏兔VX2腫瘤化療效果的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　 空化效應(yīng)是指液體中微泡在超聲波作用下發(fā)生振蕩、膨脹、收縮、內(nèi)爆等變化，產(chǎn)生瞬態(tài)高溫、高壓、沖擊波及噴射流等多種能量釋放行為。有研究表明，超聲擊破微泡產(chǎn)生的物理流能使離體腫瘤細(xì)胞膜表面產(chǎn)生孔隙，增大細(xì)胞膜通透性，從而提高細(xì)胞藥物攝取量，增強(qiáng)藥物的細(xì)胞毒性作用，促使細(xì)胞死亡。該發(fā)現(xiàn)引起超聲界普遍關(guān)注，并嘗試將其用于治療惡性腫瘤。惡性腫瘤的治療一直是臨床工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)，化療是其主要治療手段之一，但多藥耐藥(Muti-d

2、rugresistance，MDR)的情況頻繁發(fā)生，使得化療的總體成功率不高，成為治療腫瘤的最大障礙。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞接觸了某種抗癌藥物后產(chǎn)生了對(duì)其他多種未接觸過(guò)的、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理完全不同的抗癌藥物的耐藥性。有研究表明，多因素致腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物攝取減少是MDR主要的生物化學(xué)機(jī)制之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試通過(guò)超聲增強(qiáng)離體腫瘤細(xì)胞化療效果并取得初步成果，展示出誘人前景。但在體腫瘤細(xì)胞不同于離體腫瘤細(xì)胞，前者與微泡之間有微血管及組織間隙隔離;

3、而后者微泡可緊貼離體細(xì)胞，微泡被超聲擊破產(chǎn)生的物理流與離體細(xì)胞距離近，作用力大。雖有研究報(bào)導(dǎo)，單純超聲也可使離體腫瘤細(xì)胞膜表面產(chǎn)生裂隙，增加化療藥的細(xì)胞毒性，但單純超聲作用于活體時(shí)由于生物體內(nèi)缺乏自身空化核，通常需要較高聲壓激勵(lì)才能產(chǎn)生殺傷作用，可出現(xiàn)損傷周?chē)＝M織等副作用，可控性差。載藥微泡是將治療性藥物粘附、結(jié)合或鑲嵌在微泡被膜層甚至整合在微泡內(nèi)部，在血液中可減少與其他藥物作用或體內(nèi)酶反應(yīng)，聯(lián)合超聲輻照可實(shí)現(xiàn)靶向藥物釋放，增加靶區(qū)

4、藥物濃度，達(dá)到治療病灶的目的。但由于微泡殼上載藥的“空穴”受限，載藥量少。若增加微泡壁的厚度可提高載藥量，又會(huì)加大微泡制作工藝的難度。有學(xué)者在小鼠后肢皮下建立肝癌模型，觀(guān)察到靶向超聲微泡爆破組的腫瘤伊文思藍(lán)滲出量明顯高于單純超聲輻照組，證實(shí)靶向超聲微泡爆破能增加肝癌毛細(xì)血管的瞬間通透性，加大化療藥物在組織間隙的彌散，達(dá)到治療腫瘤的目的。但微泡能否穿越血管壁上的孔隙進(jìn)入組織間隙并產(chǎn)生二次甚至多次空化還是個(gè)未知的問(wèn)題，并且超聲聲孔效應(yīng)能否在

5、活體腫瘤細(xì)胞膜上“打孔”，增加細(xì)胞膜甚至核膜通透性，增強(qiáng)腫瘤化療效果的研究也未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的:
　　 本研究利用硝酸鑭示蹤電鏡觀(guān)察活體VX2腫瘤細(xì)胞膜通透性改變，了解超聲治療儀不同聲強(qiáng)、脈沖寬度、輻照時(shí)間和不同微泡劑量下聲孔效應(yīng)致腫瘤細(xì)胞膜及核膜等超微結(jié)構(gòu)改變，能否在細(xì)胞膜甚至核膜上產(chǎn)生孔隙，并摸索出增大腫瘤細(xì)胞膜通透性的適宜聲學(xué)參數(shù);在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討超聲聯(lián)合微泡致聲孔效應(yīng)對(duì)VX2腫瘤化療效果的影響。

6、　　 材料和方法:
　　 1.主要實(shí)驗(yàn)材料
　　 實(shí)驗(yàn)儀器:CZ-906A型超聲治療儀，探頭直徑2.5cm，面積4.9cm2，聲強(qiáng)在0.21W/cm2～1.09W/cm2可調(diào)，脈沖寬度在1.21ms～6.05ms可調(diào)。PhilipsIU22彩色多普勒超聲儀，L9-3高頻線(xiàn)陣探頭，配有超聲造影模式。HitachiH-600型透射電子顯微鏡。
　　 超聲微泡:南方醫(yī)院藥學(xué)基地研制的“全氟顯”，為凍干人血白蛋白包裹全

7、氟丙烷氣體，每支用前加入3ml生理鹽水，然后緩慢搖勻制成混懸液備用。所產(chǎn)生的微泡平均直徑2.9μm，其中98％＜7μm，微泡濃度1～2×109個(gè)/ml。
　　 其他試劑:速眠新Ⅱ注射液，阿托品，3％戊巴比妥鈉，阿霉素，生理鹽水。
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康新西蘭白兔73只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5kg，由南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。VX2腫瘤組織勻漿由廣州中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 2.動(dòng)物模型制備

8、>　　 2.1超聲致微泡聲孔效應(yīng)增強(qiáng)兔VX2腫瘤細(xì)胞通透性的適宜聲學(xué)參數(shù)的研究:以0.35ml/kg速眠新Ⅱ注射液及0.25ml/kg阿托品注射液將后肢外側(cè)肌層內(nèi)荷VX2腫瘤的新西蘭白兔肌肉注射麻醉，并建立耳緣靜脈通道以注射適量3％戊巴比妥鈉，側(cè)臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，荷瘤部位及其周?chē)?.5cm處脫毛，充分暴露，碘伏及酒精先后分別消毒兩次，無(wú)菌條件下取出腫瘤，并迅速剔除周邊結(jié)締組織及中央壞死區(qū)，將保留的新鮮魚(yú)肉樣組織置于無(wú)菌生理鹽水中，眼

9、科剪將其剪成1mm3的小塊，分別接種于45只健康新西蘭白兔雙側(cè)后肢外側(cè)肌層內(nèi)，約14天后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.2超聲微泡聲孔效應(yīng)增強(qiáng)兔VX2腫瘤化療效果的實(shí)驗(yàn)研究:前與(1)相同，用眼科剪剪成1mm3的小塊后分別接種28只健康新西蘭白兔右后肢外側(cè)肌層內(nèi)，約11d后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)流程
　　 3.1超聲致微泡聲孔效應(yīng)增強(qiáng)兔VX2腫瘤細(xì)胞通透性的適宜聲學(xué)參數(shù)的研究:以聲強(qiáng)、脈沖寬度、輻照時(shí)間、微泡劑量為處理

10、因素將符合實(shí)驗(yàn)條件的38只肌層內(nèi)荷VX2腫瘤新西蘭白兔分成四組，依次考察各處理因素?？疾炷骋灰蛩馗魉介g差別時(shí)其他因素的水平固定不變。每一水平重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。嚴(yán)格設(shè)置各處理因素不同水平的條件，輻照時(shí)超聲探頭置于腫瘤體表處，同時(shí)經(jīng)靜脈通道連續(xù)、緩慢注入微泡。治療結(jié)束后立即用鋒利刀片切開(kāi)腫瘤最突出體表處并切取腫瘤邊緣?mèng)~肉樣組織，制作組織切片，利用硝酸鑭示蹤透射電鏡觀(guān)察腫瘤細(xì)胞通透性的變化，并對(duì)各處理因素的每個(gè)水平隨機(jī)選取3個(gè)腫瘤組織用以HE染

11、色病理檢查。前一處理因素的最佳參數(shù)水平確定后即可考察后一處理因素，依次得出四個(gè)因素的適宜聲學(xué)參數(shù)。
　　 3.2超聲微泡聲孔效應(yīng)增強(qiáng)兔VX2腫瘤化療效果的實(shí)驗(yàn)研究:將符合實(shí)驗(yàn)條件的24只右后肢肌層內(nèi)荷VX2腫瘤新西蘭白兔隨機(jī)分為阿霉素組、阿霉素+微泡組、阿霉素+超聲組、阿霉素+微泡+超聲組。阿霉素+微泡+超聲組經(jīng)靜脈注射化療藥，2min后運(yùn)用脈沖式超聲治療儀在腫瘤部位輻照，同時(shí)經(jīng)靜脈連續(xù)、緩慢注入微泡。阿霉素+超聲組用3ml生理

12、鹽水代替微泡緩慢推注;阿霉素+微泡組超聲治療儀不發(fā)射超聲能量;阿霉素組僅用3ml生理鹽水代替微泡緩慢推注，亦不發(fā)射超聲能量。每次作用10min，隔天治療一次。治療前采集各時(shí)間點(diǎn)二維超聲圖像和超聲造影圖像，測(cè)量腫瘤切面最大長(zhǎng)徑、厚度及寬度，觀(guān)察腫瘤體積變化。
　　 4.數(shù)據(jù)分析
　　 腫瘤細(xì)胞膜通透性改變以細(xì)胞內(nèi)鑭顆粒數(shù)目為觀(guān)察指標(biāo)，按鑭顆粒數(shù)目多少分為0-5級(jí)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，同一處理因

13、素水平間鑭顆粒數(shù)目評(píng)分比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，若同一處理因素總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)任意兩水平間進(jìn)行比較。腫瘤化療效果以腫瘤體積為觀(guān)察指標(biāo)，腫瘤體積大小用(x)±s表示，治療前、后各時(shí)間點(diǎn)、各組腫瘤體積大小比較采用單向方差分析(One-WayANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.超聲致微泡聲孔效應(yīng)增強(qiáng)兔VX2腫瘤細(xì)胞通透性的適宜聲

14、學(xué)參數(shù)的研究:聲強(qiáng)為0即超聲不發(fā)射能量時(shí)腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)未見(jiàn)鑭顆粒。聲強(qiáng)為0.21W/cm2、0.43W/cm2、0.65W/cm2時(shí)均觀(guān)察到腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)鑭顆粒存在。聲強(qiáng)是0.43W/cm2時(shí)細(xì)胞漿內(nèi)鑭顆粒數(shù)目評(píng)分較其他水平高(P＜0.01)。脈沖寬度為2.42ms時(shí)腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)鑭顆粒數(shù)目評(píng)分較其他水平高（2級(jí)，P＜0.05）。輻照時(shí)間為10min時(shí)腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)鑭顆粒數(shù)目評(píng)分與其他水平比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)鑭

15、顆粒沉積隨微泡劑量增加而有上升趨勢(shì)，劑量在0.50ml/kg時(shí)評(píng)分最高（2-3級(jí)，P＜0.05）。各處理水平下細(xì)胞核內(nèi)均未見(jiàn)鑭顆粒存在。
　　 2.超聲微泡聲孔效應(yīng)增強(qiáng)兔VX2腫瘤化療效果的實(shí)驗(yàn)研究:兔VX2腫瘤在13天的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，阿霉素+微泡+超聲組、阿霉素+微泡組、阿霉素+超聲組、阿霉素組的腫瘤平均體積，從0.42±0.36cm3、0.70±0.62cm3、0.55+0.30cm3、0.53+0.42cm3生長(zhǎng)至0.48±

16、0.44cm3、1.61±1.06cm3、1.89±0.81cm3、1.62+0.69cm3，阿霉素+微泡+超聲組腫瘤體積明顯小于其它三組(P＜0.05)。阿霉素+微泡組、阿霉素+超聲組、阿霉素組腫瘤體積大小差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。阿霉素+微泡+超聲組的腫瘤生長(zhǎng)率最小，明顯低于其他三組。阿霉素+微泡+超聲組、阿霉素+微泡組、阿霉素+超聲組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率相對(duì)于阿霉素組依次為70.4％、0.6％、-16.7％。
　　

17、 結(jié)論:
　　 1.超聲致微泡聲孔效應(yīng)不僅能在微血管內(nèi)膜上產(chǎn)生孔隙，微泡還能穿過(guò)增大的孔隙到達(dá)腫瘤細(xì)胞周?chē)慕M織間隙發(fā)生空化效應(yīng);或者微血管內(nèi)的微泡首次被超聲波擊碎后可能變成更小的微氣泡，這些更小的微氣泡受超聲輻射力的驅(qū)動(dòng)穿越增大的微血管內(nèi)皮孔隙進(jìn)入腫瘤組織間隙，并產(chǎn)生二次甚至多次聲孔效應(yīng)。
　　 2.超聲致微泡聲孔效應(yīng)引起在體腫瘤細(xì)胞膜通透性改變呈現(xiàn)一定規(guī)律性。
　　 3.適宜聲學(xué)參數(shù)下，超聲輻照聯(lián)合微泡致聲孔