Tfh細(xì)胞及其相關(guān)因子Bcl-6和Il-21在CRSwNP病人鼻息肉中的表達(dá)和意義的研究.pdf

1、本文主要分兩部分展開研究：
　　第一部分 Tfh細(xì)胞相關(guān)因子Bcl-6和IL-21在CRSwNP鼻息肉組織中的表達(dá)和意義的研究
　　研究目的:
　　鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP)是慢性鼻竇炎的類型之一，傳統(tǒng)上是一種TH2占主導(dǎo)伴有組織大量嗜酸性細(xì)胞浸潤的鼻腔鼻竇粘膜慢性炎癥性疾病。除了大量嗜酸細(xì)胞在息肉組織浸潤外，我們還可以看到B細(xì)胞在息肉組織的大量活化、聚集以及IgA、IgE在息肉組織的過度產(chǎn)生，這說明局部B細(xì)胞聚集

2、及其產(chǎn)生的IgA、IgE在CRSwNP形成過程中發(fā)揮了重要作用。
　　以往研究發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞在淋巴組織生發(fā)中心的活化、聚集以及IgA、IgE的產(chǎn)生必須有T淋巴細(xì)胞的輔助作用。過去學(xué)者一直認(rèn)為是Th2細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞輔助B淋巴細(xì)胞的過程中發(fā)揮了主要作用。但有研究顯示缺乏Th2發(fā)育關(guān)鍵因子的老鼠仍然可以形成生發(fā)中心，仍然可以引起T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)，這就提示Th2細(xì)胞可能在B細(xì)胞聚集和免疫球蛋白的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了有限的作用。
　

3、　濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh細(xì)胞）是新近發(fā)現(xiàn)的不同于Th1和Th2的CD4+T細(xì)胞（輔助性淋巴細(xì)胞，Th）的一個(gè)亞群。
　　2011年Crotty提出，Tfh是主要負(fù)責(zé)輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的T細(xì)胞亞群，細(xì)胞在生發(fā)中心(GC)是Tfh輔助B細(xì)胞的部位，Tfh細(xì)胞在生發(fā)中心的形成，選擇高親和力B細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞或漿細(xì)胞并分泌大量IgA、IgE等免疫球蛋白，以及維持長時(shí)間的體液免疫應(yīng)答等方面都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。并提出Bcl-6是控制CD4+

4、T細(xì)胞分化為Tfh的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Tfh細(xì)胞能夠表達(dá)各種不同類型細(xì)胞分子，如細(xì)胞因子IL-21，趨化因子受體5(CXCR5)，共刺激誘導(dǎo)分子(ICOS)和程序死亡因子1(pd-1)。
　　IL-21是Tfh細(xì)胞執(zhí)行效應(yīng)功能的主要細(xì)胞因子，其作用的主要靶細(xì)胞是B細(xì)胞，在B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞依賴抗原的初始免疫應(yīng)答、再次免疫應(yīng)答以及體液免疫長期的維持中都發(fā)揮了主要作用。
　　近期研究發(fā)現(xiàn)Tfh細(xì)胞通過細(xì)胞因子IL-21在生發(fā)中心通過調(diào)節(jié)

5、B細(xì)胞分化成記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞，分泌大量IgA、IgE等免疫球蛋白，發(fā)揮調(diào)節(jié)人類機(jī)體免疫的功能。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)Tfh細(xì)胞參與了許多免疫系統(tǒng)及炎癥性疾病的發(fā)生過程，如:支氣管哮喘、自身免疫性肝炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，但Tfh細(xì)胞是否參與了CRSwNP的發(fā)病過程并不明確。
　　本研究旨在通過檢測CRSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和白細(xì)胞介素21（IL-21）的表達(dá)，及其與CD20（B細(xì)胞標(biāo)志抗原）、Ig

6、A、IgE在鼻息肉中的表達(dá)情況的關(guān)系，探討Tfh細(xì)胞在CRSwNP形成過程中是否發(fā)揮了作用。
　　研究方法:
　　以2013年3月-2014年3月期間就診并行手術(shù)治療的22例CRSwNP病人的鼻息肉組織為實(shí)驗(yàn)組。并根據(jù)鼻息肉范圍對(duì)病人評(píng)分（分別記為1，2，3分）。1分:鼻息肉僅僅在中鼻道內(nèi)部;2分:鼻息肉超出中鼻道但還未達(dá)到下鼻甲下緣;3分:鼻息肉超過上述范圍或多發(fā)性鼻息肉。以12例因腦脊液鼻漏、眶壁骨折需手術(shù)治療病人的鼻腔

7、、鼻竇粘膜組織為對(duì)照組。通過免疫組化檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中Bcl-6+、CD20+（B細(xì)胞標(biāo)志性分化抗原）細(xì)胞的表達(dá)分布，觀察Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞在鼻息肉組織中的分布情況;Real time PCR(RT-PCR)檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中Bcl-6、IL-21在mRNA水平的表達(dá);Western Blot檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中在蛋白水平Bcl-6的表達(dá);ELISA檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中IL-21、IgA、IgE的表達(dá)。然后對(duì)所得數(shù)據(jù)

8、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，客觀反映在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中上述各種因子的表達(dá)是否存在差異。
　　研究結(jié)果:
　　Bcl-6+細(xì)胞廣泛分布于鼻息肉組織的固有層中，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量明顯增高，且3分CRSwNP亞群患者息肉組織中Bcl-6+細(xì)胞的表達(dá)遠(yuǎn)高于2分者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　不論是在mRNA水平還是在蛋白水平，Bcl-6、IL-21在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且在m

9、RNA水平Bcl-6的表達(dá)與IL-21表達(dá)呈正相關(guān)。
　　CD20+細(xì)胞（B細(xì)胞）廣泛分布于鼻息肉組織的固有層中，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組CD20+細(xì)胞、IgA、IgE表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。且在實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)了6例CD20+細(xì)胞、IgA、IgE表達(dá)均明顯增高的具有生發(fā)中心樣結(jié)構(gòu)(G-C like structure)的典型病例。
　　研究結(jié)論:
　　Tfh細(xì)胞相關(guān)因子Bcl-6、IL-21在CRSw

10、NP病人鼻息肉組織中表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示Tfh細(xì)胞可能參與了鼻息肉的形成;CD20+B細(xì)胞、IgA、IgE在實(shí)驗(yàn)組病人鼻息肉組織中表達(dá)與Tfh細(xì)胞同步增高，提示在B細(xì)胞增殖、分化和免疫球蛋白的產(chǎn)生過程中可能是Tfh細(xì)胞提供了關(guān)鍵性輔助作用。
　　第二部分 Tfh細(xì)胞在CRSwNP不同亞型鼻息肉組織中流式細(xì)胞學(xué)研究
　　研究目的:
　　根據(jù)以往臨床經(jīng)驗(yàn)及先前的研究發(fā)現(xiàn)， CRSwNP病人病情的嚴(yán)重程度、手術(shù)預(yù)后與病人

11、是否伴有組織嗜酸性細(xì)胞浸潤、病人是否同時(shí)伴有支氣管哮喘以及病人是否為復(fù)發(fā)性CRSwNP密切相關(guān)，而且我們實(shí)驗(yàn)的第一部已經(jīng)證實(shí)Tfh細(xì)胞可能通過為B細(xì)胞的增殖、分化和免疫球蛋白的產(chǎn)生提供幫助的方式參與了CRSwNP的形成。在此基礎(chǔ)上，我們根據(jù)CRSwNP是否伴有組織嗜酸性細(xì)胞浸潤、是否同時(shí)伴有支氣管哮喘以及病人是否為復(fù)發(fā)性CRSwNP將病人分為不同亞型，并利用流式細(xì)胞術(shù)分析Tfh細(xì)胞在CRSwNP、對(duì)照組及其不同亞型鼻息肉組織中的表達(dá)，觀

12、察疾病的嚴(yán)重程度是否與Tfh細(xì)胞的表達(dá)情況具有相關(guān)性。
　　研究方法:
　　根據(jù)CRSwNP病人鼻息肉組織中是否具有生發(fā)中心樣結(jié)構(gòu)、是否伴有組織嗜酸性細(xì)胞浸潤、是否同時(shí)伴有支氣管哮喘以及是否為復(fù)發(fā)性CRSwNP，將病人分為不同的亞型，CRSwNP鼻息肉組織或正常對(duì)照鼻腔鼻竇粘膜經(jīng)勻漿器勻漿后提取上清液。由于Tfh細(xì)胞是Th細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞）的一個(gè)亞群，Bcl-6是Tfh細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化因子，所有Bcl6+CD4+T細(xì)胞即為

13、Tfh細(xì)胞。我們用流式細(xì)胞儀分析檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組組織提取液中的Bcl6+CD4+細(xì)胞（Tfh細(xì)胞）占全部CD4+T細(xì)胞的比例，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。
　　研究結(jié)果:
　　CRSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細(xì)胞占全部CD4+細(xì)胞的比例明顯高于對(duì)照組(P＜0.01）;具有生發(fā)中心樣結(jié)構(gòu)(GC+)CRSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細(xì)胞的比例明顯高于不具有生發(fā)中心樣結(jié)構(gòu)者(P＜0.01）;伴有組織嗜酸性細(xì)胞(EOS+)浸潤C(jī)

14、RSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細(xì)胞的比例明顯高于非嗜酸性細(xì)胞浸潤者(P＜0.01);同時(shí)伴有支氣管哮喘CRSwNP病人(AS+)鼻息肉組織中Tfh細(xì)胞的比例明顯高于不伴有哮喘者(P＜0.01）;復(fù)發(fā)性CRSwNP病人鼻息肉組織中Tfh細(xì)胞的比例明顯高于初發(fā)者(P＜0.01）。
　　研究結(jié)論:
　　Tfh細(xì)胞在CRSwNP的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，此結(jié)果與第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Tfh細(xì)胞相關(guān)因子Bcl-6、IL-21在CRSwNP病

15、人鼻息肉組織中表達(dá)明顯高于對(duì)照組）相一致，進(jìn)一步說明了Tfh細(xì)胞在CRSwNP發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用;Tfh細(xì)胞在具有生發(fā)中心樣結(jié)構(gòu)病人、伴有組織嗜酸性細(xì)胞浸潤病人、伴有支氣管哮喘病人以及復(fù)發(fā)性CRSwNP病人中的表達(dá)高于相應(yīng)對(duì)照組，說明Tfh細(xì)胞在鼻息肉組織中表達(dá)情況與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。由于Tfh細(xì)胞在不同亞型CRSwNP病人中的表達(dá)存在差異，提示Tfh細(xì)胞可以作為Tfh細(xì)胞病人病情嚴(yán)重程度以及手術(shù)預(yù)后的新的生物學(xué)指標(biāo)，也提示我