新型M細胞靶向性DNA疫苗的制備及其對CVB3病毒性心肌炎的免疫保護作用.pdf

1、黏膜免疫系統(tǒng)作為人體抵抗外來病原體的第一道防線，發(fā)揮重要的抗病毒作用。通過在腸黏膜表面誘生特異性的黏膜免疫應答可以有效抵抗病毒和細菌等的攻擊，從而控制感染程度。因此黏膜疫苗的開發(fā)受到了研究者的親睞，但是由于黏膜疫苗誘生免疫應答能力的不足和誘導免疫耐受的傾向，目前只有少量的黏膜疫苗研制成功并投入使用。因此在黏膜疫苗的的研制過程中如何提高其免疫應答能力成為一個急需解決的問題。
　　M細胞是位于派氏結中的一種特化的上皮細胞，數(shù)量較少[1

2、]。其基底部是不連續(xù)的，能夠允許淋巴細胞的自由通過，有利于其抗原轉運速率的提高。與其鄰近腸上皮細胞相比，M細胞頂膜面缺乏較厚的糖萼結構和粘液，這使得M細胞頂膜的關鍵受體易于被細菌或病毒識別并結合，促進其對外來病原體的識別。因此，我們利用M細胞這種特殊的結構設計了一種新型的M細胞靶向性疫苗。
　　GP2是一類糖蛋白，作為抗原識別受體特異性的表達于小腸上皮M細胞頂膜面，是第一個被發(fā)現(xiàn)在人和小鼠M細胞表面均能表達的分子，具有更好的特異性

3、。已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Ⅰ型菌毛蛋白FimH能夠與GP2特異性結合。因此，我們在實驗室原有疫苗CS-pVP1的基礎上引入FimH蛋白，設計一種新型的黏膜遞送系統(tǒng)，從而評估其的誘生CVB3特異性的黏膜免疫應答及其對CVB3誘導的病毒性心肌炎的保護作用。目前我們已有的結果:
　　一、CS-FimH-DNA遞送系統(tǒng)的構建及其特性研究
　　M細胞靶向遞送系統(tǒng)CS-FimH-pVP1的制備及其理化性質的研究:通過EDC活化FimH蛋白的羧基，

4、使其能夠與CS的氨基相互作用進而使兩者偶聯(lián)到一起，制備成CS-FimH靶向遞送系統(tǒng)。采用復合物共沉淀法將已制備好的FimH-CS遞送系統(tǒng)與pcDNA3.1-vp1質粒混合制成實驗所需的納米粒。結果顯示:
　　(1)我們的偶聯(lián)效率大約為60％，即接近60％的FimH蛋白與CS發(fā)生偶聯(lián)反應。
　　(2)在CS-FimH靶向系統(tǒng)的保護下，DNA可以避免被DNaseI酶解，很好的保護了DNA使其能夠順利到達靶向部位。通過粒徑檢測發(fā)現(xiàn)

5、該納米粒的粒徑大約在200-400nm之間。
　　二、口服免疫誘生的CVB3特異性免疫應答及免疫保護
　　靶向性疫苗CS-FimH-pVP1口服免疫小鼠后誘導的CVB3特異性黏膜免疫應答:我們的實驗組為CS-FimH-pVP1，對照組為CS-pVP1，空載對照組CS-FimH-pcDNA3.0和CS-pcDNA3.0。隔周免疫BALB/c小鼠，共免疫四次，每次免疫的質?？偭繛?5ug。末次免疫后兩周CVB3攻毒，檢測該疫苗誘

6、生的CVB3特異性的黏膜免疫應答。結果顯示:
　　(1)靶向性疫苗CS-FimH-pVP1經(jīng)口服后可以誘導高水平的黏膜IgA抗體，但是沒有顯著誘生高水平的血清IgG水平。
　　(2)靶向性疫苗CS-FimH-pVP1經(jīng)口服后可以促進IgA抗體親和力成熟，但是IgG的抗體親和成熟沒有顯著差異。
　　(3)CVB3特異性的T細胞殺傷活性(CTL)檢測發(fā)現(xiàn)與對照組CS-pVP1免疫的小鼠發(fā)現(xiàn)，經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1

7、免疫的小鼠的MLN部位能有誘生較強的CTL，具有統(tǒng)計學意義。
　　(4)CVB3特異性淋巴細胞增殖實驗顯示發(fā)現(xiàn)與對照組CS-pVP1免疫的小鼠發(fā)現(xiàn)，經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1免疫的小鼠在MLN部位誘生了有效的淋巴細胞增殖反應。
　　(5)IFN-γ+ ELISPOT實驗檢測小鼠脾臟和MLN部位T細胞分泌IFN-γ+能力，發(fā)現(xiàn)經(jīng)實驗組CS-FimH-pVP1免疫的小鼠MLN部位T細胞分泌IFN-γ+的能力顯著高于對照組C

8、S-pVP1，但是在脾臟部位T細胞分泌IFN-γ+的能力與對照組相比并沒有顯著增強。
　　評估靶向性疫苗CS-FimH-pVP1對感染CVB3的小鼠的免疫保護作用。結果顯示:
　　(1)末次免疫兩周后的小鼠經(jīng)CVB3腹腔感染后開始稱量小鼠體重，觀察感染病毒小鼠體重變化情況，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)靶向性疫苗CS-FimH-pVP1免疫過的小鼠感染CVB3后體重變化較少，體毛順滑，飲食正常。而對照組CS-pVP1小鼠的體重下降較為明顯，且小

9、鼠狀態(tài)較差，活動減少。
　　(2)CK、CK-MB可以作為診斷心肌炎的一個重要指標。CK、CK-MB的檢測結果顯示CS-FimH-pVP1免疫組的CK及CK-MB的指標明顯低于CS-pVP1免疫組，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明經(jīng)CS-FimH-pVP1免疫過后的小鼠的心肌炎的癥狀較輕。
　　(3)由CVB3感染而引起的急性心肌炎以心肌細胞的壞死和炎性細胞的浸潤為特征。心肌病理切片結果顯示空載組小鼠的心肌細胞損壞嚴重并

10、夾帶炎癥，炎性淋巴細胞成團分布;而CS-pVP1組小鼠的心肌壞死有所減輕，只有少量的炎性淋巴細胞聚集在一起成團分布和壞死灶的數(shù)量也有所減少;CS-FimH-pVP1組小鼠的心肌細胞損壞最少，炎性細胞成團現(xiàn)象也明顯減少，無明顯異常，正常心肌細胞病理切片狀態(tài)相似。
　　(4)CS-FimH-pVP1免疫組小鼠感染病毒后心臟病毒滴度的測定結果顯示:FimH-CS-pVP1免疫組小鼠心肌細胞的TCID50明顯低于對照組CS-pVP1。說明

11、FimH-CS-pVP1免疫組誘生的黏膜免疫應答能夠有效清楚小鼠感染的CVB3病毒。
　　(5)為進一步評價各組疫苗誘生的免疫保護效應，取末次免疫后兩周的小鼠進行致死劑量攻毒結果發(fā)現(xiàn)空載組在第七天左右全部死亡，對照組CS-pVP1大約有40％的生存率，而CS-FimH-pVP1免疫組則有大約接近70％的生存率。
　　(6)小動物超聲成像系統(tǒng)可以監(jiān)測小鼠心臟的收縮和舒張指標，從而評價小鼠的心功能水平FimH-CS-pVP1免疫

12、組小鼠左心室收縮壓以及射血分數(shù)的數(shù)值趨于正常組小鼠，相比于對照組CS-pVP1有顯著提高，說明FimH-CS-pVP1可以明顯改善感染CVB3病毒小鼠的心功能。
　　三、CS-FimH-pVP1增強黏膜免疫應答的機制
　　靶向性疫苗CS-FimH-pVP1口服免疫誘生的CVB3特異性的黏膜免疫應答的機制化探討
　　(1)體外成功構建M細胞模型。UEA-1的表達證明我們的M-cell體外模型構建成功。
　　(2)

13、M細胞對CS-FimH-pVP1納米粒的轉運效率的檢測顯示M細胞對CS-FimH-pVP1納米粒的轉運效率隨著時間的增加而逐漸提高，并且顯著高于對照組CS-pVP1。
　　(3)免疫熒光的方法分析該納米粒的CS-FimH-pVP1是否是通過GP2的介導而被M-cell所攝取，我們可以發(fā)現(xiàn)，具有靶向性能力的CS-FimH-pVP1納米粒與GP2具有較多的共定位，而對照組CS-pVP1則幾乎沒有與GP2的共定位。
　　綜上所述，