多殺菌素抗性西花薊馬轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及nAChR α5和α7亞基的克隆分析.pdf

1、西花薊馬Frankliniella occidentalis(Pergande)是一種世界性的園藝作物上的主要害蟲，可為害蔬菜、花卉和果樹等多種作物。目前對(duì)于西花薊馬的防治包括生物防治、物理防治以及廣泛使用的農(nóng)藥防治等多種方法，其中藥劑防治最為普遍。但由于西花薊馬發(fā)育周期短、繁殖力強(qiáng)、具有單雙倍體繁殖系統(tǒng)，以及雜食性的特點(diǎn)，西花薊馬可通過多種途徑對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性，成為抗藥性最為嚴(yán)重的害蟲之一。國(guó)外已有西花薊馬對(duì)防治其最有效的藥劑——多

2、殺菌素產(chǎn)生了極高水平抗性的報(bào)道，國(guó)內(nèi)西花薊馬對(duì)多殺菌素的敏感性也呈下降趨勢(shì)。根據(jù)已有文獻(xiàn)，不同多殺菌素抗性西花薊馬種群的抗性機(jī)理存在明顯差異，研究本地區(qū)西花薊馬對(duì)多殺菌素的抗性機(jī)制對(duì)西花薊馬的抗性治理具有十分重要的意義。本文研究了西花薊馬在低溫下的生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖狀況，對(duì)多殺菌素敏感和抗性西花薊馬的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，并根據(jù)RNA-seq結(jié)果對(duì)西花薊馬煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)α5和α7亞基進(jìn)行了克隆和分析。上述研究可進(jìn)一步了解西花薊

3、馬的生物學(xué)特性、闡明西花薊馬對(duì)多殺菌素的抗性機(jī)制，為西花薊馬的有效防治提供理論依據(jù)。
　　常年用多殺菌素處理的豆角飼喂該殺蟲劑的抗性種群，通過不斷的汰選，抗性種群對(duì)多殺菌素的LC50＞3，000mg/L，抗性倍數(shù)穩(wěn)定在10，000倍以上，達(dá)到了極高抗性水平。敏感種群不接觸任何藥劑，兩種群隔離飼養(yǎng)，為后續(xù)研究奠定了試蟲基礎(chǔ)。
　　通過對(duì)5℃和10℃環(huán)境下西花薊馬生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等狀況的觀察研究，發(fā)現(xiàn)西花薊馬具有較高的低溫耐受性，

4、在5℃下西花薊馬無法完成生命周期，卵無法正常孵化，1齡若蟲可以發(fā)育到2齡，但2齡若蟲不能繼續(xù)發(fā)育至蛹;蛹能夠發(fā)育至成蟲但成蟲不能產(chǎn)卵;10℃下西花薊馬能夠完成生活史，但是發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng)。結(jié)果表明，低溫導(dǎo)致西花薊馬的發(fā)育速度減慢，后代數(shù)量驟減，但西花薊馬轉(zhuǎn)移至室溫環(huán)境后，能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)，說明其具有很強(qiáng)的低溫耐受性。
　　對(duì)多殺菌素敏感和抗性種群進(jìn)行RNA-seq，得到了西花薊馬的68，358個(gè)unigenes基因，其中與殺蟲劑抗

5、性相關(guān)的20類基因共1655個(gè)unigenes，能夠與NCBI-NR庫(kù)中已公布基因比對(duì)上的基因565個(gè)，在目前尚無西花薊馬基因組數(shù)據(jù)的情況下，這無疑很大程度地豐富了西花薊馬的基因數(shù)據(jù)信息;經(jīng)差異基因分析，發(fā)現(xiàn)兩種群間差異表達(dá)基因2，618個(gè)，其中抗性種群內(nèi)表達(dá)上調(diào)的基因1，231個(gè)，表達(dá)下降的基因1，387個(gè);發(fā)現(xiàn)抗性種群中與SOD相關(guān)的基因過表達(dá)，上調(diào)倍數(shù)247倍;抗性種群的細(xì)胞色素P450s的上調(diào)倍數(shù)也高于本家族其他基因的下調(diào)倍數(shù)。

6、經(jīng)過對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)的qPCR驗(yàn)證，證明RNA-seq得到的差異表達(dá)基因是可靠的，可用于指導(dǎo)對(duì)西花薊馬多殺菌素抗性的產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行研究。
　　在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，克隆獲得了西花薊馬nAChRα5亞基和nAChRα7亞基基因CDS全長(zhǎng)，經(jīng)同源比對(duì)確定這兩個(gè)基因?yàn)槲骰ㄋE馬該受體的α5和α7基因;它們的表達(dá)量在兩種群間均無顯著差異。nAChRα7在兩種群間無序列差異，而nAChRα5在抗性種群中存在A-E五種轉(zhuǎn)錄本，在敏感種群中只有